动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）是急性冠脉综合症和脑卒中等众多心血管疾病（cardiovasculardiseases,CVDs）共同的病理基础。其可能的发病机制为:动脉血管内皮细胞（endothelial cell,EC）受到各种有害刺激（高血压、高血糖、高血脂和氧化应激等）时被激活,分泌粘附分子,促进白细胞粘附,增加内皮通透性;氧化的低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein,ox-LDL）渗入EC间隙,与巨噬细胞的清道夫受体结合并被摄取,从而形成巨噬源性泡沫细胞;EC分泌的细胞因子和生长因子诱导血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）增殖并迁移成新的内膜;同时,纤维组织、VSMCs、巨噬细胞和T淋巴细胞等构成纤维帽;最终,损伤的EC、泡沫细胞、大量脂质、钙质沉积和病理血管重建构成斑块核心;斑块破裂即发生急性心血管事件。微小RNA（microRNA,miR）是一种非蛋白编码的小分子单链RNA,在机体的生长发育过程中可以作为类癌基因、抑癌基因或者信号分子,调控各类细胞的增殖、迁移、分化及凋亡。在AS的发病中,miR在影响EC增殖、VSMCs转化和迁移、脂质代谢和炎性因子分泌等环节均发挥调控作用。由于miR在AS发病、治疗和预后等阶段中均具有重要作用,因此,外源性调节miR是未来AS治疗潜在的用药策略。miR-29可以通过结合干扰素-γ（Interferon,IFN-γ）直接抑制IFN-γ的产生,也可以参与核因子κB（nuclear factor kappa-B,NF-κB）信号通路的调控,极有可能通过调控炎症因子的分泌参与AS的发生发展。肿瘤坏死因子受体超家族成员1A（tumor necrosis factor receptor superfamily member1A,TNFRSF1A）参与细胞凋亡、炎症应答、信号转导、细胞因子和趋化因子介导信号转导途径,诱导NF-κB活性、正调控转录自RNA聚合酶Ⅱ启动子和正调控炎症应答等细胞活动。在前任学者和生物信息预测分析中,都发现了 miR-29a-3p和TNFRSF1A的靶向关系。因此,本研究拟通过ox-LDL诱导的VSMCs体外实验,研究miR-29a-3p对细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响;并通过TNFRSF1A拯救实验,研究miR-29a-3p影响AS进程的调控机制;最终通过AS小鼠体内实验,研究miR-29a-3p对脂质调控和斑块形成的影响。本研究为揭示AS的发病及调控机制奠定实验室基础,为探讨外源性miR治疗AS的用药策略提供潜在靶点。本学位论文由以下三部分组成:第一部分miR-29a-3p抑制ox-LDL诱导的VSMCs增殖、迁移和侵袭目的:探讨miR-29a-3p在ox-LDL诱导的VSMCs增殖、迁移和侵袭中的作用。方法:本研究采用VSMCs细胞系,通过浓度梯度预实验选择ox-LDL的最佳处理浓度为 100 μg/mL。同时将正常对照（normal control,NC）mimic 和 miR-29a-3p mimic分别转染至VSMCs中,通过RT-PCR验证目的miR转染细胞系的建立。正式实验设立对照组、ox-LDL 处理组,ox-LDL+NC mimic 处理组,ox-LDL+miR-29a-3p mimic处理组4组VSMCs细胞。首先,以100 μg/mL ox-LDL处理除对照组其余3组细胞,收集处理0h、24h、48h、72h各时间点4组细胞,采用Cell Counting Kit-8（CCK8）检测细胞活力,观察细胞增殖能力的改变。然后,以处理浓度100 μg/mL和处理时间24h为处理条件,对4组细胞进行软脂克隆实验、划痕实验、Transwell实验,在显微镜下拍摄实验结果,并对结晶紫计数、划痕愈合度、迁移/侵袭细胞数行统计分析。最终收集4组细胞,提取细胞蛋白行Western-blot（WB）实验,检测增殖相关蛋白增殖细胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen,PCNA）、Ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白的改变。结果:1.我们对对照组、ox-LDL 处理组,ox-LDL+NC mimic 处理组,ox-LDL+miR-29a-3p mimic 处理组 4 组 VSMCs 细胞进行了 miR-29a-3p RT-qPCR 水平检测,结果发现ox-LDL处理组miR-29a-3p水平较对照组显著降低（相对表达量:0.52±0.07 比 1.04±0.07,P=0.002）;而在选择性增强内源性 miR-29a-3p mimic 及 NC mimic后,发现ox-LDL+miR-29a-3p mimic处理组miR-29a-3p表达量显著高于ox-LDL+NC mimic 处理组（相对表达量:0.65±0.06 比 0.53±0.06,P=0.041）。研究结果表明,内源性增强目的miR细胞系建立成功。2.CCK8检测发现ox-LDL+miR-29a-3p mimic处理组的细胞增殖活力显著低于ox-LDL+NC mimic 处理组（330.13± 32.2%比 645.68±62.20%,P＜0.01）。软脂克隆实验也表明ox-LDL+miR-29a-3p mimic组的细胞增殖数（结晶紫计数）少于ox-LDL+NC mimic 组（911.00±44.24 比 1724.00± 52.54,P=0.0003）。进一步通过WB蛋白检测,发现ox-LDL处理组Ki-67和PCNA蛋白翻译水平较对照组显著升高（相对表达量:3.42±0.12 比 1.00±0.08,P＜0.001;相对表达量:4.28±0.31 比 1.00±0.15:P＜0.001）;而miR-29a-3p mimic可以特异性地抑制这种升高（相对表达量:2.04 ± 0.27 比 3.41±0.15,P＜0.001;相对表达量:2.42±0.33 比 4.33±0.19,P＜0.001）。3.划痕实验和Transwell实验表明转染miR-29a-3p mimic的VSMCs较转染NC mimic的细胞迁移和侵袭能力均明显下降（划痕愈合度:52.78±2.18%比80.57±2.96%,P=0.002;侵袭细胞数:63.67±3.28 比 146.70±6.69,P＜0.001）,而转染 NC mimic的VSMCs较单纯ox-LDL诱导的细胞迁移和侵袭能力没有明显改变（划痕愈合度:80.57±2.96%比 84.30±2.29%,P＞0.05;侵袭细胞数:146.70±6.69 比 157.30±6.39,P＞0.05）。4.ox-LDL处理组MMP-2和MMP-9蛋白表达水平较对照组显著升高（相对表达量:3.58±0.25 比 1.00±0.17,P＜0.001;相对表达量:3.49±0.20 比 1.00±0.16,P＜0.001）;而miR-29a-3pmimic可以特异性地抑制这种升高（相对表达量:1.80±0.14比 3.79±0.19,P＜0.001;相对表达量:1.56±0.11 比 3.86±2.33,P＜0.001）。结论:1.内源性增强miR-29a-3p细胞系建立成功。2.过表达miR-29a-3p可以抑制ox-LDL诱导的VSMCs细胞的增殖、迁移和侵袭,并通过下调MMP-2、MMP-9,增加AS斑块的稳定性,从而抑制AS的发生发展。第二部分过表达靶基因TNFRSF1A可逆转miR-29a-3p导致的VSMCs增殖、迁移和侵袭抑制目的:明确miR-29a-3p与肿瘤坏死因子受体超家族成员1A（tumor necrosis factor receptor superfamily member1A,TNFRSF1A）间的靶向关系,揭示 miR-29a-3p 通过调控TNFRSF1A影响AS斑块破裂的进程。方法:通过RT-qPCR和WB检测VSMCs细胞系（第一部分实验细胞留样）中过表达miR-29a-3p后TNFRSF1A转录和翻译水平的改变,并通过双荧光素报告实验证实miR-29a-3p和TNFRSF1A的靶向关系。本研究共设立NC mimic+pcDNA-3.1组,miR-29a-3p mimic+pcDNA-3.1 组和 miR-29a-3p mimic+pcDNA-3.1-TNFRSF1A 组 3 组。首先,采用商品化的空载质粒和TNFRSF1A质粒转染miR-29a-3p过表达的VSMCs细胞,并以转染空载质粒和NC mimic的VSMCs细胞为对照。以100μg/mL ox-LDL处理各组细胞0h、24h、48h、72h,采用CCK8检测各时间点细胞活力,观察细胞增殖能力的改变。然后,对3组细胞进行软脂克隆实验、Transwell实验,在显微镜下拍摄实验结果,并对结晶紫计数、迁移/侵袭细胞数行统计分析。最终提取处理24h细胞蛋白行WB实验,检测增殖PCNA、Ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白的改变。结果:1.在 ox-LDL 诱导的 VSMCs 中,转染 miR-29a-3p mimic 的细胞系 TNFRSF1A mRNA 转录较转染 NC mimic 的低（相对表达量:1.91±0.11 比 2.83±0.10,P=0.003）;蛋白表达量随之降低（相对表达量:1.94±0.12比3.88±0.12,P=0.0003）。双荧光素报告实验结果表明,野生型TNFRSF1A组miR-29a-3p mimic荧光活性较突变型显著降低（相对表达量:0.26±0.03比0.99±0.09,P＜0.001）。研究表明miR-29a-3p可靶向抑制TNFRSF1A的转录与翻译。2.通过对 NC mimic+pcDNA-3.1 组,miR-29a-3p mimic+pcDNA-3.1 组和miR-29a-3p mimic+pcDNA-3.1-TNFRSF1A 组 3 组 VSMCs 细胞 CCK8、软脂克隆实验、WB实验的检测,我们发现转染了 miR-29a-3p mimic+pcDNA-3.1-TNFRSF1A组中被miR-29a-3p mimic抑制的细胞增殖能力得到提升（72h增殖活力:434.28± 25.68%比611.11±36.23%,P=0.002;结晶紫计数:1368.67±87.90 比 875.33±82.56,P=0.002;Ki-67 相对表达量:0.52±0.05 比 0.35±0.05,P=0.012;PCNA 相对表达量:0.60±0.05比 0.37±0.06,P=0.006）。3.我们通过Transwell实验检测各组细胞迁移及侵袭情况,结果表明miR-29a-3p mimic+pcDNA-3.1组较NC mimic+pcDNA-3.1组细胞迁移能力明显下降（迁移细胞数:78.33±6.03 比 167.67±11.50,P＜0.001;侵袭细胞数:63.67±5.51 比 156.00±9.85,P＜0.001）,而转入TNFRSF1A过表达质粒后,细胞迁移抑制和侵袭抑制得到逆转（迁移细胞数:118.33±9.45 比 78.33±6.03,P=0.003;侵袭细胞数:96.67±11.02 比 63.67± 5.51,P=0.009）。4.最后,我们通过 WB 检测发现,miR-29a-3p mimic+pcDNA-3.1-TNFRSF1A 组MMP蛋白表达水平较miR-29a-3p mimic+pcDNA-3.1组显著升高（MMP-2相对表达量:0.79±0.03 比 0.42±0.04,P=0.0002;MMP-9 相对表达量:0.80±0.06 比 0.35 ±0.05,P=0.0006）。表明过表达TNFRSF1A可以逆转miR-29a-3p导致的MMP-2和MMP-9蛋白降低,从而降低AS斑块的稳定性,加速AS发展进程。结论:1.VSMCs细胞系中miR-29a-3p和TNFRSF1A存在靶向调控关系。miR-29a-3p可以特异性的结合野生型TNFRSF1A的3’-UTR端。2.过表达TNFRSF1A可以逆转miR-29a-3p导致的VSMCs增殖、迁移和侵袭抑制,并且逆转MMP-2、MMP-9蛋白的表达抑制,降低AS斑块的稳定性,加速AS发展进程。第三部分miR-29a-3p抑制动脉粥样硬化小鼠脂质代谢进程目的:探讨miR-29a-3p对AS模型小鼠主动脉组织病理发展的影响及对小鼠血脂浓度的改变。方法:本研究共采用20只ApoE-/-雄性小鼠,分为对照组、AS组、AS+NC mimic组、AS+miR-29a-3p mimic组4组,每组5只小鼠。随机将20只小鼠分为4组,其中5只对照组正常喂养,15只高脂饲料喂养12周以建立AS模型。其中,AS+NC mimic组和AS+miR-29a-3p mimic组从第10周开始通过颈静脉注射腺病毒载体连接的miR-29a-3p mimic以及NC mimic。造模结束后脱臼法处死小鼠,留取每只小鼠血清及主动脉组织。RT-qPCR检测各组小鼠主动脉组织miR-29a-3p、TNFRSF1A的表达情况;WB检测各组小鼠主动脉组织TNFRSF1A翻译水平的改变;全自动分析仪检测各组小鼠血清中甘油三脂（triglyceride,TG）、低密度胆固醇（Low Density Lipoprotein-Cholesterol,LDL-C）、高密度脂蛋白（High Density Lipoprotein-Cholesterol,HDL-C）的含量;HE染色和Masson染色检测各组小鼠主动脉病理改变情况。结果:1.AS小鼠造模成功,小鼠未死亡。AS模型组miR-29a-3p水平较对照组显著降低（相对表达量:0.31±0.02比1.00±0.05,P=0.0002）,记对照组表达率为1.00;而在选择性增强内源性 miR-29a-3p mimic 及 NC mimic 后,AS+miR-29a-3p mimic 组miR-29a-3p 水平显著高于 AS+NC mimic 组（相对表达量:0.96±0.01 比 0.25±0.01,P＜0.0001）。2.在AS小鼠模型中,模型组+miR-29a-3p mimic组TNFRSF1A转录较模型组+NC mimic组降低（相对表达量:2.34±0.15比3.00± 0.08,P=0.017）;蛋白表达量也随之降低（相对表达量:1.70±0.14比3.60±0.24,P=0.002）。3.AS模型组TG和LDL-C均显著高于对照组（2.46±0.06比0.45±0.02 mmol/L,P＜0.0001;12.59±0.48 比 2.07±0.09 mmol/L,P＜0.0001）,HDL-C 显著低于对照组（3.11±0.07 比 1.73±0.06 mmol/L,P＜0.0001）;进行 mimic 转染后,AS+miR-29a-3p mimic 组 TG、LDL-C 均较 AS+NC mimic 组下降（1.83± 0.06 比 2.46±0.04 mmol/L,P=0.0009;6.93±0.33 比 13.34±0.48 mmol/L,P=0.0004）;HDL-C则升高（2.11±0.07 比 1.84±0.04 mmol/L,P=0.027）。4.HE染色和Masson染色提示,对照组小鼠主动脉血管内膜无粥样斑块形成,其余三组小鼠动脉内膜明显增厚。三组动脉内膜可见不同程度的纤维斑块及脂质斑块,且斑块表面有胶原纤维覆盖,纤维帽较薄,胶原纤维含量少,三组中AS+miR-29a-3p mimic组斑块最小。结论:1.AS造模小鼠血清TG、LDL-C水平升高,HDL-C水平降低,HE染色和Masson染色表明小鼠动脉内膜出现斑块,证明AS小鼠造模成功。2.在小鼠体内miR-29a-3p和TNFRSF1A也存在靶向调控关系。miR-29a-3p mimic转染后,较NC mimic转染组,小鼠TNFRSF1A转录和翻译水平降低,血清TG、LDL-C水平降低,HDL-C水平升高,动脉内膜斑块减小。实验表明,过表达miR-29a-3p在小鼠体内可以调节脂质代谢,抑制斑块形成,从而抑制AS发生发展。