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银杏叶提取物制剂对人类的心血管等疾病有较好的疗效,其中含有的槲皮素、山奈酚、异鼠李素等物质是银杏叶药物制剂质量控制检测的主要物质。黄酮类化合物因其独特的吸收特性而能够在植物中充当紫外线过滤器,因此适当的UV-B辐射能够促进黄酮类化合物的生物合成。本研究以银杏实生苗为主要试验材料,分别对其进行低剂量与高剂量的UV-B辐射处理,发现两处理组下银杏叶中黄酮醇的含量均显著增加;进一步通过生理学、分子生物学、生物信息学和遗传转化等技术对UV-B辐射下的银杏植株展开研究,主要取得以下结果:(1)形态学观察发现,UV-B处理7-14d后,只有高剂量处理14d的银杏植株受到轻微胁迫,表现为叶片的黄化。处理21d后,银杏叶片的生活力显著降低,且UV-B辐射下银杏植株受胁迫的表现方式主要为叶片的黄化、卷曲、甚至萎蔫焦枯。银杏叶中活性氧代谢也发生了变化,处理7d后H2O2含量即显著增加,其中处理14d后H2O2含量增加幅度最大;MDA含量和CAT活性均呈先上升后下降的变化趋势,均在处理14d后达到峰值;SOD活性在高剂量处理后期显著增加;此外GST活性在高剂量处理前期快速增强。(2)利用HPLC-MS对银杏叶中的黄酮醇含量进行测定,发现UV-B处理后,银杏叶中总黄酮醇苷的含量是对照的1.82倍;其中异鼠李素的含量达到对照的16-42倍,且高剂量处理14d后含量达到峰值;UV-B处理7d后银杏叶中槲皮素的含量即迅速升高,且高剂量处理14d后含量达到峰值,达到对照的2.37倍;山奈酚的含量在UV-B处理前期也有少量增加;表明长期UV-B辐射可显著提高银杏叶黄酮醇(尤其是槲皮素及异鼠李素)的含量。(3)对转录组数据进行分析,发现4种抗氧化酶CAT、POD、APX和GST共有28个基因差异表达。其中1个CAT2基因Gb_38467上调表达;上调表达的GST基因共6个,其中Gb_18136上调表达程度最高;POD基因大部分下调表达;3个APX基因全部下调表达。结合生理数据,表明在UV-B辐射下,CAT、GST这两种酶在清除活性氧的过程中可能发挥主要作用。(4)在UV-B信号通路中共发现4个差异表达的基因,包括3个UVR8基因Gb_14008,Gb_31523和Gb_40615,1个COP1基因Gb_15627。荧光定量PCR结果表明Gb_14008上调表达,Gb_15629下调表达。保守结构域分析发现两者分别与拟南芥At UVR8和At COP1具有相似的结构域。在类黄酮合成通路中,共鉴定到18个差异表达的结构基因。其中FLS和F3’H两种酶基因呈现上调表达趋势。荧光定量PCR结果发现F3’H基因Gb_19792,Gb_04545和Gb_11520,FLS基因Gb_22751与转录组测序结果一致,表明以上基因可能通过响应长期的UV-B辐射来参与黄酮醇的生物合成。此外,在差异的转录因子家族中,MYB转录因子是最大的家族类群。荧光定量PCR验证了3个MYB转录因子基因Gb_18153,Gb_40629和Gb_05115下调表达,ODO1基因Gb_38090上调表达,2个bZIP转录因子基因Gb_00122和Gb_12012均上调表达。(5)对银杏Gb_12012和Gb_00122进行生物信息学分析,发现两者均具有bZIP的特征结构域N-x7-R/K-x9-L-x6-L-x6-L,且Gb_12012与拟南芥At HY5的保守结构域相似,均具有HY5的特征结构域。进化树分析发现,银杏Gb_12012与拟南芥At HY5及小立碗藓Pp HY5之间的亲缘关系较近。对银杏Gb_12012基因进行p ENTR-L12-MCS和p K7WGF2-GFP双元载体构建,得到的克隆序列长度为774 bp。进一步进行烟草叶片的瞬时转化,亚细胞定位结果发现该基因主要定位在细胞核中,少量分布在细胞膜上。表明该HY5基因可能主要在细胞核中发挥调控作用。