类猪圆环病毒分子流行病学调查及小鼠感染模型的相关研究

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类猪圆环病毒P1(Porcine Circovirus-like Virus P1)是我们从临床疑似感染断奶仔猪多系统衰竭综合征(Post-weaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)病猪的血清中检测到的,P1是环状、单股DNA病毒,全长648个核苷酸,是目前已知的基因组最小的动物病毒,与猪圆环病毒Ⅱ型(Porcine circovirus type 2,PCV2)开放阅读框(Open reading frame 2,ORF2)高度同源。遗传进化分析表明P1与PCV2起源于共同的祖先,动物试验证明P1与PCV2类似,可引起猪感染后出现类似PMWS的临床症状。本试验对江苏省9个地区进行P1分子流行病学调查,分析其流行及遗传变异情况;通过建立P1感染乳鼠模型探究不同途径接种对乳鼠致病性的影响,在此基础上研究P1种间传播方式、对生殖系统的影响以及P1与PCV2体内相互作用对病毒复制的影响。试验一、江苏省类猪圆环病毒P1分子流行病学调查为了解江苏省类猪圆环病毒P1流行及毒株变异情况。本试验运用PCR技术对江苏省330份血清进行P1和PCV2的流行病学调查,并对P1阳性样品进行全基因组测序,对P1全长及ORF1与参考毒株进行序列比对及同源性分析。结果P1阳性率为13%(43/330);PCV2阳性率为11%(36/330);P1与PCV2共感染率为3%(10/330)。全基因组测序共获得12株P1全长序列,核苷酸同源性在99.4%-100%,ORF1核苷酸同源性在99.1%-100%;与参考毒株相比,ORF1核苷酸同源性在99.4%-100%,氨基酸同源性在99.1%-100%。其中有三株毒株与来自羊、牛、兔的P1核苷酸序列相同。结果表明,2016年江苏省各地区P1、PCV2感染率及混合感染率较低,毒株变异较小,同时证明P1具有广泛的宿主,同一毒株也具有跨物种传播的可能性。试验二、不同途径接种类猪圆环病毒P1感染性克隆对乳鼠致病性的影响为了探究不同途径接种类猪圆环病毒P1感染性克隆对乳鼠致病性的影响,将P1感染性克隆以脑、肝脏以及肌肉三种途径接种新生乳鼠。在乳鼠接种后第7、14和21天,分别取心、肝、脾、肺、肾、脑等各组织,采用荧光定量PCR对各组织P1进行定量检测,同时进行病理组织学变化分析。结果三种接种方式均在乳鼠体内检测到P1,接种后第7天组织的病毒含量均明显高于第14天和第21天的,而且以肌肉接种途径的乳鼠各组织病毒载量为最高。组织病理学结果表明,P1感染对乳鼠的心、肝、肺、肾、脑可造成不同程度的病理损伤。试验结果表明肌肉接种为P1在乳鼠内的增殖提供了一个良好的方式。试验三、母鼠通过垂直传播感染乳鼠的P1病毒检测和病理学观察为了探究P1能否通过母鼠垂直感染乳鼠,总共40只(雌、雄各20只)6周龄SPF级BALB/c小鼠,其中将20只(雌、雄各10只)小鼠通过肌肉接种P1感染性克隆用于试验。接种7天后,再将小鼠分为A、B、C和D四组:A组5只接种雌鼠和5只接种雄鼠;B组5只接种雌鼠和5只未接种雄鼠;C组5只未接种雌鼠和5只接种雄鼠;D组5只未接种雌鼠和5只未接种雄鼠作为阴性对照。将每组小鼠分为5笼,每笼雌、雄各一。乳鼠出生后,取每组0日龄乳鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑和胃(乳汁)进行PCR检测;并取雌鼠及雄鼠的生殖器官(子宫、输卵管、卵巢和睾丸)采用HE染色及免疫组化的方法观察各组织的病理变化及对P1抗原进行定位。结果A、B和C三组中部分雌鼠产出死胎,PCR检测均在0日龄乳鼠中检测到P1;病理学检测结果表明子宫、输卵管、卵巢和睾丸均有不同程度的病理损伤,且免疫组化检测到P1抗原阳性信号。试验四、P1与PCV2体内协同感染对病毒复制影响的初步探究为了初步探究P1与PCV2体内协同感染对病毒复制的影响,本试验将48只四周龄SPF级BALB/c小鼠随机分为四组:P1攻毒组、PCV2攻毒组、P1与PCV2共同攻毒组和阴性对照组,每组各12只。分别在攻毒第7、14、21和28天每组处死3只小鼠并采集心、肝、脾、肺、肾,采用荧光定量PCR的方法对各组织中病毒含量进行分析。结果与对照组及单独攻毒组相比,P1与PCV2共同攻毒组P1与PCV2病毒含量明显增高,表明在小鼠体内P1与PCV2相互促进复制,可能存在协同致病作用。
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