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环孢子虫是一种重要的水源性寄生原虫,可以引起人和动物的严重腹泻。本论文对首次从广州猴粪中发现的疑似环孢子虫卵囊进行了形态学观察和分子鉴定,并建立了相应的巢式PCR检测方法。
采用饱和蔗糖漂浮法、改良抗酸染色法和孢子化试验以及蔗糖密度梯度离心法首次从广东某猴场的猴粪中分离到疑似环孢子虫卵囊。该卵囊在光学显微镜下呈圆形,直径为7.5-10μm,卵囊内含折光性小体,淡绿色。经改良抗酸染色后,卵襄呈淡红色、深红色或不着色。孢子化卵囊中含有两个孢子囊,每个孢子囊中含有两个子孢子,这些特征均与己报道的人环孢子虫(Cyclospora cayetanensis)形态特征基本一致,符合环孢子虫属特征,而有别于艾美尔球虫。
采用巢式PCR和普通PCR方法,针对环孢子虫属18S rDNA和ITS-1基因设计3对引物,扩增该猴源环孢子虫的目的片段,并进行序列分析。通过PCR扩增,获得的18S rDNA目的片段长712bp,测序结果表明该猴源环孢子虫18S rDNA基因与C.colobi、C.papionis.C.cayetanensis的相似率较高,在进化树上位于同一分支。获得的ITS-1+片段长760bp,其中ITS-1序列高度特异,在Genbank中未见同源性序列。结果表明本次从猴粪中分离的疑似环孢子虫卵囊应属于环孢子虫属,但其种类的确定还有待于进一步研究。
根据实验获得的猴源环孢子虫18SrDNA基因序列,设计特异性引物对CYJS/CYJA,以含猴源环孢子虫18SrDNA基因片段的阳性重组质粒为标准模板,进行PCR条件的优化,与内套引物NS18Sa/NS18Ss一起使用,建立了猴源环孢子虫的巢式PCR检测方法。用于猴源环孢子虫和对照寄生虫基因组DNA检测时,只有猴源环孢子虫基因组DNA能扩增出特异性条带;敏感性试验结果表明,对阳性参照的最小检测量为0.2fg。应用该巢式PCR检测方法对87份猴粪样品进行了临床检测,并与常规检测方法进行了比较。结果表明该巢式PCR检测方法的检出率比常规检测方法提高了2.3%-3.4%,显示出该检测方法具有特异、敏感、简便、快捷等优点,对开展环孢子虫病的鉴别诊断和分子流行病学调查具有重要的应用价值。