【摘 要】
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目的:幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,Hp）是一种在自然界中普遍存在的细菌,是一种革兰阴性、微需氧菌,在全世界50%以上人口的肠道内定植,它感染胃窦上皮区并持续很长时间。Hp感染会导致一些消化系统外的疾病,包括神经系统、皮肤病、血液病、眼科疾病、心血管疾病、代谢疾病和过敏性疾病等。Hp感染是否会引起骨骼肌衰减尚未见报道。本实验通过研究Hp感染促进IL-1β升高导致C57BL/6
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目的:幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,Hp）是一种在自然界中普遍存在的细菌,是一种革兰阴性、微需氧菌,在全世界50%以上人口的肠道内定植,它感染胃窦上皮区并持续很长时间。Hp感染会导致一些消化系统外的疾病,包括神经系统、皮肤病、血液病、眼科疾病、心血管疾病、代谢疾病和过敏性疾病等。Hp感染是否会引起骨骼肌衰减尚未见报道。本实验通过研究Hp感染促进IL-1β升高导致C57BL/6小鼠骨骼肌发生衰减的表现以及抑制C2C12细胞增殖分化来探讨骨骼肌衰减的机制从而为肌少症的治疗及预防提供新的思路。方法:1.哥伦比亚培养基培养Hp,通过革兰染色、过氧化氢酶试验、尿素酶试验等方法验证Hp是否培养成功。2.以C57BL/6小鼠作为动物模型,研究Hp感染导致的炎症反应对小鼠骨骼肌（腓肠肌、比目鱼肌）的影响。（1）HE染色和Warthin-Starry银染色观察Hp是否在小鼠胃粘膜定植成功。（2）酶联免疫吸附试验（ELISA）检测小鼠血清中炎症因子的表达。（3）HE染色观察小鼠腓肠肌组织,小鼠比目鱼肌组织的炎症浸润程度以及小鼠骨骼肌的病理变化情况。（4）免疫组化观察IL-1β、MYOG的表达。（5）实时荧光定量PCR（qPCR）检测NF-κB、IL-1β、MYOD、MYOG的m RNA表达水平。（6）蛋白印迹（Western blot）检测p NF-κB、IL-1β、IL-6、MYOD1、MYOG的蛋白表达水平。3.以C2C12细胞作为细胞模型,研究IL-1β干预对其增殖分化的影响。（1）CCK8和EdU检测细胞增殖情况。（2）流式细胞术检测细胞周期变化。（3）qPCR检测NF-κB、IL-1β、MYOD、MYOG的m RNA表达水平。（4）Western blot检测p NF-κB、IL-1β、IL-6、MYOD1、MYOG蛋白表达情况。（5）Western-blot检测Hippo信号通路相关蛋白Mst1/2、pLATS1/2、YAP、pYAP的表达。结果:1.Hp培养完成,革兰染色为阴性杆菌,呈现红色杆状或海鸥展翅状菌体;Hp能分泌大量过氧化氢酶,H2O2试验阳性;Hp能产生大量尿素酶,能够分解尿素产生氨气,尿素酶试验阳性。2.Hp感染激活NF-κB通路使IL-1β升高导致C57BL/6小鼠骨骼肌发生衰减（1）Hp定植胃上皮成功,与对照组相比,随Hp菌液浓度的增加,胃上皮定植成功的细菌数量增多。（2）小鼠血清中的IL-1β等炎症因子的表达量增加（P<0.05）。（3）随Hp菌液浓度的增加,小鼠肌肉组织炎症浸润程度增强。（4）小鼠骨骼肌中IL-1β的表达量增加,而分化相关蛋白MYOG的表达量下降（P<0.05）。（5）小鼠腓肠肌、比目鱼肌中NF-κB、IL-1β的m RNA水平表达逐渐增强,MYOD、MYOG表达逐渐降低（P<0.05）,具有浓度依赖性。（6）小鼠腓肠肌、比目鱼肌中p NF-κB、IL-1β和IL-6炎症相关蛋白表达逐渐增强,肌肉分化相关蛋白MYOD1、MYOG表达逐渐降低（P<0.05）,具有浓度依赖性。3.IL-1β通过激活Hippo信号通路抑制C2C12成肌细胞增殖和分化（1）IL-1β干预细胞,Ed U阳性的增殖细胞减少;加入NF-κB抑制剂PDTC后,Ed U阳性的增殖细胞增加。（2）IL-1β干预细胞,处于G0/G1期细胞增多,进入S期的细胞减少;加入NF-κB抑制剂PDTC后,处于G0/G1期细胞减少,而进入S期的细胞增多。（3）IL-1β导致C2C12细胞中NF-κB、IL-1β的m RNA水平表达增强,MYOD、MYOG表达降低;加入NF-κB抑制剂PDTC后,NF-κB、IL-1β的m RNA水平表达降低,MYOD、MYOG表达增加（P<0.05）。（4）IL-1β导致C2C12细胞中p NF-κB、IL-1β和IL-6炎症相关蛋白表达增强,分化相关蛋白MYOD1、MYOG表达降低;加入NF-κB抑制剂PDTC后,p NF-κB、IL-1β、IL-6表达降低,MYOD1、MYOG表达增加（P<0.05）。（5）IL-1β促进Hippo信号通路相关蛋白LATS1/2、YAP磷酸化,PDTC预处理后,磷酸化的LATS1/2、YAP蛋白表达减低（P<0.05）。结论:Hp感染C57BL/6小鼠激活NF-κB通路使IL-1β升高可能是导致C57BL/6小鼠骨骼肌衰减的主要原因。IL-1β抑制C2C12细胞增殖分化可能是通过激活Hippo信号通路最终导致C2C12成肌细胞衰减。这为研究骨骼肌衰减的发生机制提供理论基础,为肌少症等疾病的防治提供新的思路。
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