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研究背景:胰岛素抵抗是2型糖尿病主要病理特征之一,在肝脏组织中表现为糖原合成减少、肝糖输出增加等。研究表明,在糖尿病病人以及糖尿病小鼠体内TXNIP表达显著升高,TXNIP在机体葡萄糖代谢及糖尿病的发生发展中发挥重要作用。然而,TXNIP在肝脏胰岛素抵抗中的作用及意义尚不明确。目的:1.建立TXNIP过表达和敲除纯合子小鼠模型,观察小鼠体重和空腹血糖一般特征,观察其口服葡萄糖耐量、胰岛素耐量情况及肝脏胰岛素抵抗表现。2.证实TXNIP通过影响胰岛素信号通路IRS-1/AKT/GSK3β调控肝脏胰岛素敏感性。方法:1.建立TXNIP过表达和敲除纯合子小鼠模型。2.每4周检测小鼠体重和空腹血糖及24周时血清生化指标检测。3.对8周和24周小鼠进行葡萄糖耐量和胰岛素耐量检测。4.RT-PCR法检测肝脏TXNIP基因表达情况。5.PAS染色观察肝脏糖原累积情况,糖原试剂盒检测肝脏组织糖原含量。6.Western blot方法检测肝脏TXNIP、IR、胰岛素信号通路相关指标IRS-1、AKT、GSK3β蛋白,GLUT2蛋白的表达。结果:1.TXNIP纯合子小鼠模型成功建立普通PCR法对鼠尾DNA进行检测,鉴定出纯合子小鼠。TXNIP-KI小鼠同时存在329bp和335bp大小的片段,不存在412bp片段。TXNIP-KO小鼠存在262bp,不存在407bp片段。实时荧光定量PCR检测小鼠肝脏TXNIP基因表达,进行反转扩增。结果所示,过表达鼠中TXNIP被大量扩增,敲除鼠没有扩增出TXNIP。通过Western blot实验检测小鼠肝脏TXNIP蛋白的表达情况。过表达鼠TXNIP蛋白表达明显增加,TXNIP敲除鼠蛋白几乎不表达。以上结果显示,TXNIP-KI和TXNIP-KO纯合子小鼠模型构建成功。2.TXNIP纯合子小鼠的一般特征与WT鼠相比,TXNIP-KI鼠的体重降低,TXNIP-KO鼠体重在12周前增加,12周后降低。与WT鼠相比,TXNIP-KI鼠的空腹血糖是高的,且随时间的推移不断升高,而TXNIP-KO鼠空腹血糖是降低的,随时间的变化一直保持较低水平。24周血清脂代谢相关指标结果显示,与WT鼠相比,TXNIP-KI鼠的LDL是增加的,TXNIP-KO鼠TC、HDL的含量都是增加的。体重,血糖,脂代谢相关指标的变化提示,TXNIP纯合子小鼠出现糖脂代谢异常。3.TXNIP过表达鼠糖耐量和胰岛素耐量受损OGTT实验检测小鼠口服葡萄糖耐量变化。结果显示,与WT鼠相比,8周和24周的TXNIP-KI鼠血糖迅速上升,但下降缓慢,而TXNIP-KO鼠的血糖缓慢上升,且能够快速回落至正常范围。ITT实验检测小鼠的胰岛素耐量情况。与WT鼠相比,8周和24周的TXNIP-KI鼠血糖下降缓慢且幅度较低。与WT鼠相比,8周的TXNIP-KO鼠血糖变化无差异,但24周时血糖快速下降并快速回升。以上结果提示,TXNIP-KI小鼠出现糖耐量异常,胰岛素敏感性降低,而TXNIP-KO小鼠则会改善这种表现。4.TXNIP过表达小鼠发生胰岛素抵抗结合空腹血糖和空腹胰岛素值,计算胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）。HOMA-IR结果显示,与WT鼠相比,8周和24周的TXNIP-KI鼠发生了胰岛素抵抗,但是TXNIP-KO鼠无胰岛素抵抗发生。与WT鼠相比,TXNIP-KI鼠的第一时相胰岛素分泌无差异,提示TXNIP-KI鼠的胰岛β细胞的功能暂时无缺陷。5.TXNIP过表达小鼠肝糖原含量减少利用PAS染色观察肝组织糖原的累积情况。结果显示,与WT鼠相比,TXNIP-KI鼠肝脏中玫红色物质数量少,颜色浅,提示糖原累积减少,而TXNIP-KO鼠肝脏组织中玫红色物质颜色深且数量多,糖原累积是增多的。利用试剂盒检测肝脏组织糖原的含量,结果与PAS染色一致。以上结果提示,TXNIP-KI鼠确有胰岛素抵抗的表现。6.TXNIP过表达小鼠GLUT2蛋白在细胞膜上表达增加利用Western blot实验对肝脏中分别提取的细胞膜膜上和细胞内蛋白进行检测。结果显示,与WT鼠相比,TXNIP-KI鼠中GLUT2蛋白在细胞膜上表达增加,在细胞内表达减少。与WT鼠相比,TXNIP-KO鼠GLUT2蛋白在细胞膜上表达降低,在细胞内表达增加。以上结果有力提示,TXNIP-KI小鼠存在胰岛素抵抗表现。7.TXNIP过表达抑制小鼠肝脏IR蛋白表达及下游胰岛素信号转导利用Western blot方法检测小鼠肝脏中胰岛素受体的表达量,胰岛素信号通路中P-IRS-1、P-AKT、P-GSK-3β蛋白的表达情况。结果显示,与WT鼠相比,TXNIP-KI鼠胰岛素受体蛋白和P-IRS-1、P-AKT、P-GSK-3β蛋白的表达均降低,而TXNIP-KO鼠这些蛋白的表达则会增加。以上结果提示,TXNIP-KI鼠的肝脏胰岛素信号通路受损。结论:TXNIP通过下调胰岛素受体表达及下游IRS-1/AKT/GSK3β胰岛素信号通路降低肝脏胰岛素的敏感性,从而参与调控糖尿病的发生发展。