烟碱是烟草主要生物碱,占总生物碱的90%以上,烟碱从根部合成运输到叶片积累,乙烯反应因子（AP2/ERFs）转录因子家族和碱性螺旋-环-螺旋（BHLH）转录因子家族对烟碱生物合成的调控已被广泛研究。研究表明,NICOTINE2（NIC2）基因座位点上的转录因子AP2/ERF单独或联合b HLH转录因子MYC2共同激活烟碱合成途径中编码关键酶基因的表达,虽然已知NIC2位点转录因子和MYC2响应茉莉酸（JA）等植物激素的诱导,但对这些转录因子在翻译后水平的调控知之甚少。本研究鉴定了烟草蛋白磷酸酶PP2C2家族B亚族成员NtPP2C2b,对该基因进行了表达特性分析,深入研究了NtPP2C2b对烟碱合成途径的调控作用;通过酵母双杂交试验筛选到一个与NtPP2C2b互作的丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）NtMPK4,进一步研究了NtMPK4对烟碱生物合成的调节作用;此外,还探索了另一个蛋白磷酸酶NtMKP1对烟碱生物合成途径的调节。本研究揭示了烟草烟碱生物合成途径的翻译后调控机制,即蛋白磷酸酶和MAPK协同作用于NIC2基因座位点AP2/ERFs转录因子的上游,精细调节烟草中烟碱的生物合成。主要获得以下研究成果:（1）、通过系统进化分析,将烟草中的PP2Cs划分为16个亚族,其中B亚族包含10个PP2C基因。氨基酸序列比对表明,NtPP2C2b与拟南芥B亚族PP2C成员（AP2C1、AP2C2和AP2C3）有60%的序列相似性。在NtPP2C2b中还发现存在一个保守的激酶相互作用基序（KIM）:[（K）X（R）3-4x1-6（L）X（I）]。共表达分析和q RT-PCR分析表明,NtPP2C2b在烟草中的表达与烟碱生物合成途径中的关键基因表达模式高度相似,并且其表达受茉莉酸（JA）的诱导,表明NtPP2C2b可能参与了烟碱生物合成的调控。（2）、NtPP2C2b在转基因毛状根和转基因烟草植株中的过表达显著抑制了PMT、QPT、A622和BBL等关键酶基因以及NIC2基因座关键转录因子ERF221的表达。此外,过表达NtPP2C2b也减少了转基因毛状根和烟草植株中烟碱的积累。瞬时表达分析表明,NtPP2C2b和ERF221在烟草细胞中的共表达显著抑制了QPT启动子的活性。这些发现表明,NtPP2C2b在ERF221的上游发挥作用,并负调控烟草中烟碱的生物合成。（3）、酵母双杂交和基于烟草原生质体的双杂交试验表明,NtMPK4与NtPP2b在酵母和植物细胞中相互作用,提示NtMPK4是NtPP2C2b的潜在底物。在酵母细胞中,NtMPK4通过KIM基序与NtPP2C2b相互作用。此外,与单独过表达ERF221相比,NtMPK4和ERF221共表达提高了烟草细胞中QPT启动子的活性,表明NtMPK4是烟碱生物合成的正调控因子。（4）、NtMPK4在烟草毛状根中的条件性过表达显著增加了烟碱途径关键酶基因和转录因子的表达。此外,与对照相比,过表达NtMPK4增加了毛状根中烟碱的积累。这些发现进一步表明,NtMPK4正向调节烟草中烟碱的生物合成途径。（5）、研究了另一种蛋白磷酸酶NtMKP1对烟碱合成途径的调节。与NtPP2C2b类似,NtMKP1在根中高表达,并受茉莉酸诱导。NtMKP1在转基因毛状根和转基因烟草中的过表达抑制了烟碱合成途径关键酶基因和转录因子的表达,并减少了烟碱的积累。与单独过表达ERF189相比,NtMKP1和ERF189在烟草细胞中的共表达降低了PMT启动子的活性。这些发现表明,NtMKP1可能作为烟草烟碱生物合成途径的负调控因子,在ERF189上游发挥作用。综上所述,本研究揭示了蛋白磷酸酶NtPP2C2b、NtMKP1和蛋白激酶NtMPK4调控烟碱合成途径的翻译后调控机制,为烟草烟碱含量的代谢工程提供了新的思路和方向。