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第一部分 微环境响应性免疫调控静电纺丝支架的制备和性能表征目的:制备定向微环境响应性免疫调控静电纺丝复合支架,并表征其理化特性。方法:首先分别通过逆向蒸发法和静电纺丝技术制备负载IL-4质粒的醛基化阳离子脂质体和构建装载神经生长因子(NGF)的氨基化定向微溶胶静电纺丝纤维,之后二者通过酸敏感性化学键希夫碱键连接,得到微环境响应性免疫调控促神经再生复合纤维支架。最后分别通过动态光散射粒度分析仪、扫描电镜(SEM)、透射电镜(TEM)、原子力学显微镜(AFM)、水接触角仪(WCA)、X射线光电子能谱(XPS)、红外光谱分析(FTIR)、ELISA、机械试验系统等方法评估其形貌及性能。结果:通过动态光散射粒度分析仪检测不同比例醛基化阳离子脂质体与IL-4质粒复合物(pDNA/aLiposome)发现由于带正电荷脂质体与负电荷pDNA存在相互静电吸附作用,因此当pDNA浓度降低时脂质体粒径减小而表面电荷增大,同时阳离子脂质体包封率下降。另外转染大鼠骨髓间充质干细胞72h后观察eGFP荧光强度证明pDNA/aLiposome 比例在1:2.5时,荧光共定位重复率最高(0.69±0.005%)(p<0.05),同时ELISA试剂盒检测在该比例时IL-4分泌量达到最大(p<0.05),继而筛选该比例pDNA/aLiposome进行后续研究。通过SEM、TEM、AFM、XPS和取向度评估复合微溶胶静电纺丝纤维支架表面形貌和内部结构,证明负载IL-4质粒的阳离子脂质体成功接枝在纺丝表面,并且纤维内部具有明显核壳结构能够保护并缓释NGF。之后经过FTIR和dsDNA试剂盒更进一步证实已成功构建复合仿生免疫调控静电纺丝纤维支架,而且IL-4质粒负载率约为19%。同时杨氏模量、降解速率、水接触角、孔隙率结果进一步表明该复合支架的材料性能得到不同程度改进。最后通过配置不同pH的PBS溶液模拟体内损伤后酸性微环境评估阳离子脂质体和NGF的释放速率,表明复合纤维支架在酸性微环境中能够快速做出响应释放负载IL-4的阳离子脂质体并且持续释放NGF,该结果为后续细胞和动物研究提供实验基础。结论:顺利构建仿生复合免疫调控微溶胶静电纺丝纤维支架,并且该支架具有良好定向效果、力学性能、亲水性和药物控释功能。第二部分微环境响应性免疫调控静电纺丝支架生物相容性和功能的研究目的:探讨复合仿生微环境响应性免疫调控静电纺丝支架的生物相容性、免疫调控和促神经分化功能。方法:首先将BMSCs种植在复合纤维支架上,并通过Transwell板与BMMs共培养。共培养1天后,通过Integrinβ1抗体荧光标记支架上BMSCs观察纤维支架对细胞的黏附性能。共培养3天后,使用不同浓度乙醇对支架上BMSCs脱水处理,通过SEM观察支架上细胞形态变化以及活死染色试剂盒评估细胞生存能力。并配置细胞计数试剂盒-8(CCK-8)分别评估种植后1、3、5天BMSCs增殖情况。此外,将各组静电纺丝纤维植入大鼠背部皮下,以综合评价复合纤维支架体内生物相容性。其次,配置pH为5.8、6.6、7.4的α-MEM培养基分别共培养BMSCs和BMMs,于培养后1、3、5、7天通过qRT-PCR、EILSA和免疫荧光染色技术检测BMMs极化表型、促炎和抗炎基因表达及细胞因子分泌情况,模拟评估复合纤维支架的免疫调控功能。最后收集共培养10天后的BMSCs进行神经元特异性标记物染色和相应基因表达检测,评估复合纤维支架的促神经分化功能。结果:Integrinβ1荧光染色和SEM结果显示BMSCs在复合纤维支架上生长状态良好,并且定向排列的纤维能够接触引导细胞形态随纤维方向分布,表明复合纤维支架对细胞具有良好的黏附性能。结合活死染色、CCK-8和大鼠皮下HE染色实验结果表明复合纤维支架具有良好生物相容性,但是由于培养板的机械硬度更适合细胞增殖,因此与空白对照组(control)相比具有显著性差异(p<0.05)。在pH5.8的培养环境中,qRT-PCR结果显示实验组促炎基因IL-1β和TNF-α表达量随时间逐渐下降,在第7天时分别为9.63±0.80和0.30±0.03,同时抑炎基因IL-10和TGF-β表达量呈上升趋势,并与其他对照组具有显著性差异(p<0.05)。并且在pH6.6培养环境中,酸度下降引起复合纤维支架酸响应性降低,因此实验组结果显示促炎和抑炎基因表达大量改变均低于pH5.8。并且ELISA和免疫荧光染色结果与各组BMMs基因表达类似,高度提示响应性纤维支架在酸性环境中具备较高敏感度,释放负载IL-4质粒的阳离子脂质体诱导BMMs向M2型极化,从而显著抑制炎症因子,促进其分泌抑炎因子。使用四种神经元特异性标记物对培养10天的BMSCs染色和基因检测后发现微溶胶纤维支架组(MSaP、MSaP-aL、MSaP-aL/p)具有相同的诱导作用,且与空白对照组和阴性对照组具有显著性统计学差异(p<0.05),提示微溶胶静电纺丝支架具有缓慢释放NGF的功能,可促进干细胞神经分化。结论:免疫调控复合纤维支架具有良好生物相容性,可促进细胞黏附、增殖以及降低生物材料植入引起的异物反应;并且能够响应外界酸性环境快速释放IL-4阳离子脂质体诱导极化M2型巨噬细胞分泌抑炎因子和缓慢释放NGF促进干细胞神经分化。该部分实验结果为进一步动物体内研究提供理论依据。第三部分 微环境响应性免疫调控静电纺丝支架促进脊髓损伤修复的研究目的:将仿生免疫调控复合纤维束植入大鼠T9脊髓损伤模型,研究纤维支架免疫调控和促神经再生的可行性。方法:建立大鼠T9脊髓半切模型,分别植入对照组和实验组纤维束。术后1周收集局部损伤部位组织进行流式细胞术、qRT-PCR、免疫荧光染色以及ELISA检测全身血清炎症因子,综合评估复合纤维束在动物体内免疫调控功能。其次术后每周固定时间点评价大鼠下肢运动功能恢复情况并且于术后4周和8周两个时间点分别取各组脊髓样本,通过神经元特异性标志物和新生血管标记物免疫荧光染色评估复合纤维束促神经修复和血管再生情况。结果:通过流式细胞术分析脊髓损伤处样本小胶质细胞和巨噬细胞表型,结果显示实验组中CD11b/CD86阳性细胞显著减少(p<0.05),并且CD11b/CD206阳性细胞明显增多(p<0.05)表明复合免疫调控纤维束响应脊髓损伤酸性微环境发挥免疫调控功能诱导局部免疫细胞极化为M2型。同时结合局部组织免疫荧光染色和qRT-PCR检测结果,更加证明响应性免疫调控纤维支架在酸性环境中具有较高敏感性,促进局部组织分泌IL-4调节局部免疫微环境,并且M2型巨噬细胞增多后分泌抗炎细胞因子(IL-10和TGF-β)以及相对减少局部炎症因子(TNF-α和IL-1β)。提取外周全血血清进行ELISA检测炎症因子含量综合说明免疫调控纤维支架不仅能够改善损伤局部免疫微环境,更能降低全身炎症反应。术后运动功能评价结果表明,空白对照组(blank control)和阴性对照组(aP、MSaP、MSaP-aL)大鼠下肢运动功能恢复受限,且与实验组(MSaP-aL/p)具有显著性统计学差异(p<0.05)。通过免疫荧光染色技术标记损伤后4周和8周两个时间点的脊髓样本中神经元、轴突萌芽、神经祖细胞、星形胶质细胞、瘢痕组织和再生血管。GFAP和NG2染色结果证明由于复合纤维束的免疫调节功能,MSaP-aL/p组中活化的星形胶质细胞以及形成的瘢痕组织明显减少(p<0.05),并且瘢痕组织的机械屏障作用减弱,明显促进损伤部位Nestin标记的神经祖细胞归巢、血管内皮细胞(CD31)和新生血管(VWF)增多(p<0.05)。同时MSaP-aL/p组中Tuj-1标记的神经元和GAP-43标记的轴突萌芽明显多于其他对照组(p<0.05)。但是实验组中4周时GAP-43标记的轴突萌芽显著高于8周,提示脊髓损伤修复可能存在一个固定的时间窗,在急性期进行免疫调节能够更有效促进神经功能恢复。结论:用仿生复合免疫调控静电纺丝纤维在脊髓损伤急性期进行免疫调控,能够有效降低局部甚至全身炎症反应为神经再生搭建理想平台,并且在损伤后期显著减少胶质纤维酸性蛋白分泌和瘢痕组织形成,同时促进血管和神经再生,从而提高运动功能恢复。此外,GAP-43荧光标记轴突萌芽实验结果更是证明复合纤维束在急性脊髓损伤期进行免疫调节的必要性和可行性。