稻瘟病菌Pyricularia oryzae是研究植物与病原真菌相互作用的模式病原真菌,由其引发的稻瘟病是世界范围内最严重的水稻病害之一。已有一些报道表明蛋白磷酸化参与调控了稻瘟病菌的致病性、菌丝生长、分生孢子形成和胁迫应答等多个生物过程。但是,由于缺少磷酸化蛋白组学研究,蛋白磷酸化介导的调控网络及其节点仍然不清楚。在本研究中,作者首先在野生型菌株P131的菌丝阶段鉴定了 799个磷酸化蛋白及其1621个磷酸化位点,其中包括536个蛋白的899个新的磷酸化位点和31个致病相关蛋白的47个新的磷酸化位点。通过生物信息学分析,作者从这些磷酸化位点的侧翼序列中鉴定了 19个特征性磷酸基序,其中3个磷酸基序所对应的蛋白激酶目前还是未知的。尤其是,作者发现:在稻瘟病菌营养菌丝中,作用于Pmkl上游的7个蛋白均被磷酸化,而Pmk1及其下游靶标Mst12和Sf11均未被磷酸化,暗示菌丝体中处于去磷酸化状态的Pmk1对于其下游底物Mst12和Sf11可能是非功能性的。有趣的是,作者还发现:一个推测的蛋白磷酸酶Pmp1在Ser240位点被磷酸化。Pmp1在丝状真菌中相对保守,但其功能尚未被报道。因此,作者在稻瘟病菌中敲除PMP1,并在此基础上进行了Pmp1S240D的点突变互补。表型分析结果显示,△pmp1敲除体在致病力、分生孢子产生和菌落生长等方面存在明显缺陷。进一步研究显示:与野生型相较,Pmk1的磷酸化水平在敲除体△pmp1的菌丝体中显著上升,而在Pmp1S240D突变体中明显下降,说明Pmp1及其Ser240位点的磷酸化调控了菌丝体中Pmk1的磷酸化水平。更为惊奇的是,Mps1的磷酸化水平也在△pmp1敲除体中显著上升,在Pmp1S240D中明显下降。此外,作者还证明:Pmp1能够直接与Mps1互作,其AA180-230区域是两者互作所必需的。作者所属实验室在前期研究中鉴定了一个致病必需基因MoPPG1,该基因编码一个蛋白磷酸酶,其缺失还导致菌落生长缓慢。为了弄清该基因作用的分子机理,作者比较了野生型菌株P131与敲除体△moppg1菌丝体的磷酸化蛋白组,发现159个蛋白的216个位点的磷酸化水、平在敲除体△moppg1中显著上调,这些上调的磷酸化位点含有5个特征性磷酸基序,并具有被已知蛋白激酶识别的特性。KEGG通路分析显示,40个受到PPG1调控的磷酸化蛋白参与了 34个生物过程,预示着PPG1在稻瘟病菌中存在着广泛的调控靶标。在众多受到PPG1调控的磷酸化位点和蛋白中,作者选取MGG02757编码蛋白和MGG06712编码蛋白进行了重点分析。MGG02757编码蛋白与酵母蛋白激酶Dbf2和人类NDR（nuclear Dbf2-related）蛋白激酶家族同源,因此,作者将MGG02757命名为MoNDR1。MoNDR1具有保守的磷酸化位点Ser466,且在三次生物学重复的野生型菌株P131磷酸化蛋白组中均未被检测到,而在敲除体敲除体△moppg1中被重复检测。为了进一步确认MoNDR1上Ser466位点的磷酸化,作者通过Western blot对野生型P131和敲除体△moppg1中Ser466位点的磷酸化水平进行了比较分析,结果表明在敲除体△moppg1中能够检测到MoNDR1上Ser466位点的磷酸化,而在野生型菌株P131中未能检测到,说明PPG1的确调控了 MoNDR1上Ser466位点的去磷酸化。酵母双杂交和免疫共沉淀结果显示,PPG1能够与MoNDR1直接互作。此外,PPG1和MoNDR1在稻瘟病菌的侵染过程有着相似的表达动态。这些结果表明,PPG1直接调控了 MoNDR1上Ser466位点的磷酸化。进一步,作者在稻瘟病菌中敲除了 MoNDR1,并构建了 MoNDR1S466D MoNDR1S466A点突变载体,对敲除体△mondr1进行了点突互补,获得了突变体MoNDR1S466D NDR1S466A。表型测定结果显示,与野生型菌株相比,敲除体△mondr1菌落生长缓慢,产孢量减少为野生型的1/10,致病力显著减弱,说明MoNDRl在菌落生长、分生孢子形成和致病过程中起到了重要作用。组成性磷酸化MoNDR1S466D和完全去磷酸化的MoNDR1S466A突变体在菌落生长和产孢能力方面都存在明显的缺陷,说明Ser466位点的磷酸化和去磷酸化均对MoNDRl正常行使功能具有重要作用。同时对比敲除体△moppg1和敲除体△mondr1的生物学表型发现,△moppg1和△mondr1有相同的菌落生长速率,在分生孢子的发育过程中出现相同趋势的缺陷,但△moppg1在缺陷程度上更为严重。但在致病性方面,△moppg1完全丧失了对寄主的致病性,而△mondr1仍然具有侵染寄主的能力,只是在致病力上明显减弱。在植物病原真菌中尚未有关于PPG1同源物PP2A调控NDR1的报道,本研究首次证实了 PPG1在稻瘟病菌体内直接调控MoNDR1的去磷酸,从而调控其功能。因此,这对于揭示PPG1协同MoNDR1调控植物病原真菌的生长发育和致病机制具有重要意义。Met6是本研究聚焦的另外一个磷酸化蛋白,它的同源物是甲硫氨酸合成酶,在氨基酸代谢过程中具重要作用。比较磷酸化蛋白组学分析显示,它保守的Ser705位点的磷酸化强烈受到了蛋白磷酸酶PPG1的调控。为了进一步研究磷酸化位点Ser705对Met6的功能调节作用,作者在实验室已有敲除体△met6的基础上,对敲除体△met6进行了点突互补,获得了突变体Met6S705D和Met6S705A。组成性磷酸化的Met6S705D互补体展示了与△met6极为相似的缺陷,在完全培养基上菌落生长速率降低,在非完全培养基上菌丝极其稀薄,并丧失产孢能力以及致病力,而突变体Met6S705A能够完全恢复敲除体△met6在菌落生长、产孢和致病性上的缺陷,说明Ser705位点的去磷酸化作用是Met6行使功能所必需的。酵母双杂交结果显示,PPG1不能与Met6直接互作,说明PPG1对Met6的去磷酸化调控可能是间接的,或者需要桥梁蛋白（Mediator）。PP2A参与了真核生物细胞的代谢过程。但目前尚未有研究报告过PP2A与Met6之间存在调控关系。我们的研究将为揭示PP2A蛋白磷酸酶家族在代谢过程中的作用提供更多线索。综上所述,本研究在稻瘟病菌菌丝体中鉴定了许多新的磷酸化蛋白和位点,以及受到蛋白磷酸酶Pmp1和PPG1调控的磷酸化位点。尤其是发现、确定了蛋白磷酸酶Pmp1及其磷酸化位点Ser240对Mps1和Pmk1的去磷酸化作用,蛋白磷酸酶PPG1对MoNDR1和Met6的去磷酸化调控作用。这些新发现,为深入理解蛋白磷酸化动态调控稻瘟病菌菌丝生长、分生孢子产生和致病性机理提供了新的视角,对构建稻瘟病菌蛋白磷酸化介导的调控网络和揭示该菌的致病机理具有重要意义。