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2型糖尿病是一种因胰岛素分泌不足、胰岛素抵抗、或两者兼有之的以高血糖为特征的慢性代谢性疾病。越来越多的实验证据和流行病学资料显示,维生素D缺乏会增加2型糖尿病的发生风险。CYP2R1、CYP27B1、CYP24A1、GC和VDR基因是维生素D代谢、转运和发挥功能的关键基因,它们的异常表达将影响体内维生素D的水平及其生物学功能的发挥,可能增加2型糖尿病的发生风险。鉴于单核苷酸多态性(SNP)、基因拷贝数变异(CNV)、DNA甲基化等遗传及表观遗传学变异在基因表达中的作用,研究维生素D代谢通路关键基因的SNP、拷贝数变异、DNA甲基化水平与维生素D缺乏、胰岛素水平、胰岛素抵抗、2型糖尿病的关联性,对深入了解2型糖尿病发生过程中维生素D相关的分子机制,制定维生素D缺乏症和2型糖尿病的预防策略具有重要的意义。目的应用病例对照研究方法比较维生素D代谢通路中CYP2R1、CYP27B1、CYP24A1、GC和VDR基因的SNP、基因拷贝数、DNA甲基化水平在2型糖尿病病例组和对照组之间的差异,探讨它们和维生素D缺乏、胰岛素水平、胰岛素抵抗、2型糖尿病的关联性,并应用家系设计的分析方法对CYP2R1、CYP27B1、CYP24A1、GC和VDR基因的SNP、基因拷贝数、DNA甲基化水平与2型糖尿病的关联性进行验证。方法在河南省郑州市二七区侯寨乡和河南省焦作市武陟县乔庙乡两地进行的慢性病横断面调查中,选出272例2型糖尿病患者为病例组,并按同村庄、同性别、年龄相差不超3岁、同烟酒暴露及无血缘关系的原则,选出272例对照人群进行1:1匹配。同时,选择其中232例2型糖尿病先证者及其父母、同胞兄弟姐妹共618人进行家系分析。通过使用Taqman荧光探针对SNP进行基因分型,Taqman荧光探针相对定量PCR法测定基因的拷贝数变异情况,高分辨率溶解曲线法测定DNA甲基化水平,进而应用条件Logistic回归模型、FBAT和PBAT等统计方法对维生素D代谢通路基因的SNP、拷贝数变异、甲基化水平和2型糖尿病进行关联性分析。结果1.流行病学特征本研究的结果显示,蔬菜摄入不足、重度体力活动减少、静息时间增长及高BMI均是2型糖尿病的风险因素。2.维生素D代谢通路基因SNP与2型糖尿病——病例对照研究(1)SNP位点和维生素D缺乏程度的关联性结果显示,CYP2R1基因rs12794714、rs10766197位点与对照组人群的维生素D缺乏程度存在显著的关联性(P<0.05)。(2)SNP位点和胰岛素水平的关联性结果显示,CYP27B1基因的rs10877012、rs4646536位点与对照组人群的胰岛素水平具有显著的关联性(P<0.05)。(3)SNP位点和HOMA-IR指数的关联性结果显示,CYP2R1基因rs10766197位点、VDR基因rs739837位点与对照组人群的HOMA-IR指数具有显著的关联性(P<0.05)。(4)单因素Logistic模型结果显示,CYP2R1基因rs12794714、rs10766197位点,CYP24A1基因rs2248359、rs6068816位点,VDR基因rs7975232、rs2189480位点和2型糖尿病具有显著的关联性。rs12794714位点的AG基因型对2型糖尿病的风险较GG基因型提高1.699倍(Adjusted OR,1.732,95%CI 1.148-2.613,P=0.009);rs10766197位点的AG基因型对2型糖尿病的风险较GG基因型提高1.565倍(Adjusted OR,1.552,95%CI 1.027-2.344,P=0.037);rs2248359位点的TT基因型对2型糖尿病的风险较CC基因型提高1.916倍(Adjusted OR,2.261,95%CI 1.167-4.382,P=0.016);rs6068816位点的TT基因型对2型糖尿病的风险较CC基因型下降为0.497倍(Adjusted OR 0.480,95%CI 0.258-0.892,P=0.020);rs7975232位点的TT基因型对2型糖尿病的风险较GG基因型提高1.426倍,(Adjusted OR 1.489,95%CI 1.025-2.165,P=0.037);与CC基因型相比,rs2189480位点的CA基因型对2型糖尿病的风险提高2.239倍(Adjusted OR 2.207,95%CI 1.207-4.035,P=0.010),AA基因型对2型糖尿病的风险提高2.336倍(Adjusted OR 2.598,95%CI 1.386-4.870,P=0.003)。(5)多因素因素Logistic模型结果显示,CYP2R1基因rs12794714位点、CYP24A1基因rs6068816位点、VDR基因rs2189480位点和2型糖尿病存在显著的关联性。rs12794714位点的AG基因型对2型糖尿病的风险较GG基因型提高1.78倍(Adjusted OR,1.833,95%CI 1.197-2.806,P=0.005);与CC基因型相比,rs2189480位点的CA基因型对2型糖尿病的风险提高2.208倍(Adjusted OR 2.189,95%CI 1.175-4.077,P=0.014),AA基因型对2型糖尿病的风险提高2.302倍(Adjusted OR 2.599,95%CI 1.356-4.982,P=0.004);rs6068816位点的TT基因型对2型糖尿病的风险较CC基因型下降为0.481倍(Adjusted OR 0.477,95%CI0.252-0.904,P=0.023),是2型糖尿病的保护因素。(6)简单加和遗传风险评分模型的统计结果显示,与低风险分值1st组相比,高风险分值2nd、3rd和4th组均能增加2型糖尿病的患病风险(P<0.05),调整混杂因素后OR值分别为1.644(95%CI 1.046-2.584),2.418(95%CI1.455-4.020)和2.305(95%CI 1.312-4.051)。加权遗传风险评分模型的统计结果表明,与低风险分值1st组相比,高风险分值3rd和4th组能增加2型糖尿病的患病风险(P<0.05),调整混杂因素后OR值分别为2.10(95%CI 1.156-3.493)和2.951(95%CI 1.749-4.987)。3.维生素D代谢通路基因拷贝数变异与2型糖尿病——病例对照研究CYP2R1、CYP27B1、CYP24A1、GC和VDR基因的拷贝数和维生素D缺乏程度、HOMA-IR指数、2型糖尿病的相关性结果显示,CYP2R1基因拷贝数与2型糖尿病患者的维生素D缺乏程度可能存在关联性(P=0.053);CYP24A1基因拷贝数与病例组的胰岛素水平、HOMA-IR指数呈显著正相关(P<0.001);CYP27B1基因拷贝数与2型糖尿病存在显著的关联性,与低拷贝数1st组相比,高拷贝数2nd、3rd组增加了2型糖尿病的患病风险(P<0.05),OR值分别为1.635(95%CI 1.005-2.661)和1.961(95%CI 1.180-3.262),其中3rd组在调整混杂因素后仍具有统计学意义(OR 2.008,95%CI 1.176-3.427,P=0.011)。4.维生素D代谢通路基因甲基化水平与2型糖尿病——病例对照研究DNA甲基化水平和维生素D缺乏程度、HOMA-IR指数、2型糖尿病的相关性结果显示,CYP2R1、CYP27B1、CYP24A1、GC和VDR基因的甲基化水平和维生素D缺乏程度在病例组和对照组中均没有显著的关联性(P>0.05);VDR基因的甲基化水平和病例组HOMA-IR指数呈显著的负相关(r=-0.119,P=0.05);GC基因甲基化水平的升高可能会增加2型糖尿病的患病风险(OR 1.179,95%CI0.999-1.391,P=0.052),在调整混杂因素后具有统计学意义(Adjusted OR 1.222,95%CI 1.025-1.458,P=0.026)。5.维生素D代谢通路基因SNP、拷贝数变异、甲基化水平与2型糖尿病——家系设计研究(1)SNP与2型糖尿病的FBAT分析结果显示,CYP24A1基因的rs2248359和rs4809957位点,在加和模型、显性模型及隐性模型中均与2型糖尿病存在关联性(P<0.05)。其中,rs2248359位点的病例对照研究结果在家系分析中得到验证。此外,rs2248359位点在2型糖尿病家系中存在基因型不亲和性,当父母的基因型分别为CC和CT时,子代为CT基因型的几率增加了6.245倍(95%CI1.868-20.883)。(2)基因拷贝数、DNA甲基化水平与2型糖尿病的PBAT分析结果显示,CYP2R1、CYP27B1、CYP24A1、GC和VDR基因的拷贝数变异、甲基化水平与2型糖尿病均不存在显著的关联性(P>0.05),而且在先证者和父亲、母亲之间也不存在显著差异(P>0.05)。结论1.CYP2R1基因与维生素D缺乏程度、HOMA-IR指数、2型糖尿病具有显著的关联性,提示CYP2R1基因对体内维生素D水平、胰岛素敏感性具有重要的调控作用,进而影响2型糖尿病的发生和发展;2.CYP27B1基因与胰岛素水平、2型糖尿病具有显著的关联性,提示CYP27B1基因对胰岛素分泌可能具有重要的调控作用,从而影响2型糖尿病的发生;3.CYP24A1基因与胰岛素水平、HOMA-IR指数、2型糖尿病具有显著的关联性,提示CYP24A1基因可能与维生素D活性、胰岛素分泌、胰岛素敏感性的调控密切相关,从而参与2型糖尿病的发生和发展;4.GC基因甲基化水平升高可以增加2型糖尿病的患病风险,提示GC基因的异常表达可能参与维生素D生物活性的调控,从而参与2型糖尿病的发生与发展;5.VDR基因与2型糖尿病具有显著的关联性,提示维生素D的活性调控可能影响2型糖尿病的发生和发展。6.维生素D代谢通路基因的累积突变可以增加2型糖尿病的患病风险。因此,本研究结果为维生素D与2型糖尿病的关联性提供了新的证据,为制订和完善2型糖尿病的防控策略提供支撑。