坦布苏病毒（Tembusu virus,TMUV）属于黄病毒科,黄病毒属。与其他黄病毒相似,其生命周期的重要环节包括:吸附与进入、基因组RNA翻译、基因组RNA复制和病毒粒子组装与释放。对于生命周期的研究,入侵过程通常使用4℃和37℃的条件使病毒结合到细胞表面或进入到细胞中,但对操作时间有着明显的差异,细胞表面病毒粒子清除的条件也各不相同。基因组翻译过程通常使用复制缺陷型复制子或是检测病毒蛋白翻译情况,目前也出现了翻译模型研究此步骤。基因组RNA复制使用复制子系统,或是检测单个生命周期的基因组RNA水平。目前大多数的研究病毒粒子组装的是采用电镜直接观察内质网组装相关位点,这种方法虽然直观,但受限于研究单位的设备条件。在TMUV的研究中,未来新型重组活疫苗需要遗传背景清晰、进化可控、致弱机理清楚的疫苗毒株,而这严重依赖于TMUV分子病毒学的解析,但是受限于关键方法缺失、研究系统不完善等瓶颈。本研究系统建立了TMUV入侵、翻译、RNA复制、组装的研究方法。将病毒与细胞在4℃共孵育1h即可完成吸附过程,病毒和细胞在37℃共孵育总共2h可完成进入过程,孵育后使用0.025%typsin-PBS可有效清除细胞表面的病毒粒子。病毒基因组的翻译过程使用翻译系统和复制缺陷型复制子两种方法,其中翻译系统保留了TMUV翻译过程必备的5’和3’UTR以及对翻译效率关键的5’端帽子结构,用Rluc报告基因检测翻译水平。病毒基因组复制使用检测灵敏度高、易于制备的野生型复制子。并且本研究测量并绘制了野生型复制子在TMUV感染宿主细胞DEF中的复制曲线,用于比对。病毒粒子组装与释放过程使用包装系统和亚细胞片段分离实验研究,包装系统是基于野生型复制子搭配包装质粒pc DNA3.1-C16pr ME构建的,同样具备复制子的优势。亚细胞片段分离实验参考了DENV2、JEV研究进行了检测指标和条件的优化,控制采样时间为细胞出现约75%CPE,相比于电镜观察组装过程,本方法所需材料和设备门槛低,结果可定量分析。本论文建立了TMUV各生命周期研究的操作流程（OP）,并且对此系统进行了初步应用,分别简述如下:为了验证已建立的OP在病毒角度的有效性,本研究应用已建立的TMUV入侵、翻译、RNA复制、组装的OP,对6株突变病毒进行解析。基于研究病毒吸附与进入的OP,明确了突变体1-5的进入环节受损;基于病毒基因组复制OP,明确了E蛋白6个突变均没有影响病毒基因组RNA复制;基于病毒组装与释放OP,明确了突变体3-6的组装受到了破坏。为了验证已建立的OP在宿主角度的有效性,本研究应用已建立的研究TMUV入侵、翻译、RNA复制、组装的OP,对负调控环节进行了筛选和确认。基于研究病毒吸附与进入的OP,明确了鸭hnRNPA3不参与TMUV吸附与进入环节;基于病毒基因组翻译OP,明确了鸭hnRNPA3负调控TMUV基因组翻译;基于病毒基因组复制OP,明确了鸭hnRNPA3负调控TMUV基因组RNA复制,而hnRNPA3调控TMUV基因组RNA复制是由于调控翻译导致的。本研究建立了一套能够定性和定量解析TMUV入侵、翻译、RNA复制、组装的实验室方法,并运用此系统定向设计、构建并解析了TMUV毒力改变的病毒株,解析了宿主hnRNPA3调控病毒增殖的具体环节,从病毒和宿主两向明确所建立化方法的有效性和适用范围。本研究成果为解析不同毒力TMUV株的分子差异、疫苗毒株定向设计、新型重组疫苗研发等提供关键技术支撑。