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伪狂犬病(Pseudorabies,PR)又名奥叶兹基病(Aujeszky’s disease),是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)感染导致的一种以高度接触性、急性为主要特征的传染病。猪是PRV的天然宿主,且该病毒可感染各个年龄阶段的猪群,给养猪业带来了极大的威胁。不仅如此,近年来有少量关于人感染PRV的报道,表明该病毒可跨物种传播。目前疫苗接种为防控PR的主要措施,但随着变异株的出现,疫苗不能有效控制PRV的传播。因此,寻找能有效控制PRV感染的药物在PR的防控与治疗方面至关重要。杨梅素(3,5,7-三羟基-2-(3,4,5-三羟基苯基)-4H-1-苯并呋喃-4-酮)是一种含有多个羟基结构的黄酮类化合物,是蔬菜、水果、茶以及红酒等中的活性成分之一,并具有多种药理活性。本研究在PK-15细胞上探究杨梅素在体外对PRV的抑制活性及作用机制,然后建立PRV感染小鼠模型,评价杨梅素体内抗病毒活性,研究结果为PR的防控以及杨梅素作为抗病毒药物的开发提供了理论依据和应用参考。主要研究结果如下:1.杨梅素对伪狂犬病毒抑制活性评价采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法探究杨梅素对PK-15细胞的毒性作用,将连续二倍稀释的不同浓度杨梅素作用于PK-15细胞,孵育48 h后,加入CCK-8溶液在OD450处测吸光值。杨梅素半数有毒浓度(50%cytotoxic concentration,CC50)为>1000μM(μmol/L),最大无毒浓度为500μM。在最大无毒浓度下将杨梅素二倍稀释后,与PRV同时作用于PK-15细胞,通过CCK-8法测定病毒感染细胞的存活率并根据Reed-Muench法计算得到杨梅素对PRV的半数抑制浓度(50%inhibition concentration,IC50)为42.69μM。选择指数(Selectivity index,SI=CC50/IC50)为>23.24。为进一步探究杨梅素抑制PRV胞内复制活性,病毒先感染细胞后再加入药物,结果显示杨梅素抑制PRV胞内增殖的IC50为203μM;其中500μM杨梅素对PRV复制阶段的抑制率为63.2%。将PRV的初始感染量提高至感染复数(Multiplicity of Infection,MOI)分别为0.01、0.1和1,采用实时荧光定量PCR法检测PRV在细胞中的增殖情况。结果表明,杨梅素在500μM浓度下,对PRV的抑制活性并不会因病毒感染量的增加而减弱,其抑制率均可达90%以上。通过间接免疫荧光试验发现,杨梅素作用后,细胞内PRV病毒粒子显著减少。2.杨梅素抑制伪狂犬病毒作用方式研究根据病毒复制周期,设计药物对PRV吸附、穿入、复制、直接灭活作用和细胞保护作用5个独立试验,探究杨梅素对PRV的作用方式。结果表明,杨梅素对PK-15细胞没有保护作用,与PRV共孵育后能显著降低PRV的病毒滴度;同时还能抑制PRV的吸附、穿入以及在胞内的复制。为进一步探究药物作用方式,通过测定不同孵育时间对PRV灭活作用发现,杨梅素与病毒共孵育5 min即可显著降低病毒滴度,说明杨梅素可在短时间内对PRV产生灭活作用;病毒生长曲线显示,杨梅素在PRV感染6 h后产生显著的抑制效果。有研究发现PRV产生子代病毒的时间为感染后4-6 h,综合以上结果推测杨梅素抑制PRV胞内复制是通过阻断子代病毒在细胞间的传播所实现。3.杨梅素对NF-κB和MAPK信号通路以及相关细胞因子变化的影响采用Western blot检测PRV感染细胞中NF-κB以及MAPK信号通路中蛋白表达水平。结果发现,在4 hpi,病毒对照组与空白细胞组相比p-P65/P65显著降低,而杨梅素处理后,p-P65/P65显著升高,说明杨梅素能调节PRV对NF-κB通路的抑制作用;在8 hpi以后,病毒组p-P65/P65一直处于升高状态,而杨梅素在12 hpi能显著降低p-P65/P65,说明杨梅素在PRV感染后期在一定程度上能抑制NF-κB的持续性激活。PRV感染使p-P38/P38、p-ERK1/2/ERK1/2在12 hpi内显著升高,在杨梅素处理后,p-P38/P38显著降低,但p-ERK1/2/ERK1/2在12 hpi才显著下降,说明杨梅素能抑制PRV对P38 MAPK通路的激活,而ERK通路的激活在感染12 h后受到抑制。通过荧光定量PCR检测NF-κB、MAPK信号通路中相关细胞因子的转录水平。结果发现,IL-1α、IL-1β以及IL-6的转录水平在PRV感染过程中都有不同程度的上调,这可能与NF-κB的激活有关,而杨梅素处理后,能显著抑制PRV感染引起的IL-1α、IL-1β以及IL-6的转录。PRV感染能提高c-Jun、c-Fos、c-Myc以及STAT1的转录水平,这可能与MAPK被激活有关,而杨梅素能显著降低PRV感染后c-Jun、c-Fos、c-Myc以及STAT1的转录水平。4.杨梅素对PRV感染引起细胞凋亡的影响采用Annexin V-FITC/PI双染法观察PRV感染引起的细胞凋亡。结果发现杨梅素作用后,在病毒感染24 h内细胞的凋亡数量显著减少,说明杨梅素能显著抑制PRV感染引起的细胞凋亡。采用荧光定量PCR法检测病毒US3基因以及细胞凋亡相关因子表达情况,发现抗凋亡基因Bcl-2的转录水平在PRV感染期间被显著上调,而Bcl-xl被下调;促凋亡基因Bax的转录水平在感染18 h内受到抑制,在24 h被上调,而Caspase-3在感染期间被显著下调;杨梅素处理后,与凋亡相关的病毒US3基因的表达呈时间依赖性被抑制,而且杨梅素还能抑制PRV对Bcl-2、Bcl-xl、Caspase-3以及Bax基因表达的调控。5.杨梅素对PRV感染小鼠的保护作用为探究杨梅素在体内对PRV的抑制活性,将30只雌性SPF昆明小鼠随机分为三组,治疗组提前灌胃给予100 mg/kg杨梅素,连续五天,每天早晚各一次;在第6天腹腔注射0.1 m L 2×104TCID50 PRV,继续灌胃给药至病毒组小鼠死亡超过一半。结果发现病毒组小鼠在感染第3天出现了嘴角湿润流涎、眼部化脓粘黏、抓挠注射部位、萎靡、呼吸急促、喜爱趴在饮水口的明显临床症状,并在第4天有小鼠开始死亡,死亡率为40%,在第5天死亡率为70%;而杨梅素治疗组小鼠在第四天仅出现眼部化脓粘黏的症状,第5天开始死亡,死亡率为30%。通过荧光定量PCR法检测病毒基因拷贝数以指示感染小鼠各脏器中病毒含量发现,肾脏中病毒含量最高,其次是肝、肺、脾、脑以及心脏;杨梅素治疗后,PRV在各脏器组织中的基因拷贝数显著降低,说明PRV的增殖受到抑制。小鼠肝、肾以及胸腺的脏器指数在病毒感染后有所下降,而肺和脑的脏器指数升高;杨梅素治疗后肝和脑组织的脏器指数有一定程度的恢复。通过组织病理学检查发现,杨梅素治疗后能改善由PRV感染引起各脏器组织发生的病理变化。PRV感染能上调各脏器组织中MCP-1、G-CSF、IL-1α、IL-1β以及IL-6的表达,说明感染引起了炎症反应;而杨梅素治疗后,各炎症因子的转录水平都有一定程度的降低。另外,抗凋亡因子Bcl-2和Bcl-xl的转录水平在药物治疗组与病毒对照组中均有所上调;而促凋亡因子Bax和Caspase-3的转录水平在病毒感染后的不同脏器组织中发生了不同程度的降低或升高,且经药物治疗后能逆转这两种基因m RNA的表达水平。以上结果显示:杨梅素能在早期阶段抑制PRV感染细胞以及调节NF-κB和MAPK信号通路,调节病毒感染引起的炎症反应和细胞凋亡。杨梅素能抑制PRV在小鼠体内的增殖,减轻感染诱导的炎症反应,延长感染小鼠的存活时间。本研究为杨梅素在抗病毒方面的开发利用以及对伪狂犬病的防治提供了一种新思路。