君迁子DlERF10和DlNAC2基因抗寒功能研究

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君迁子(Diospyros lotus L.)是柿属植物的重要砧木,具有较强的适应性和抗逆性,因此研究君迁子的抗逆机理具有重要的意义。AP2/ERF(APETALA2/Ethylene-responsive factor)和NAC(NAM、ATAF1-2、CUC2)是植物系统中特有的转录因子家族,在植物生长发育、次级代谢及各种逆境胁迫生物学过程发挥着重要作用,但在君迁子中研究较少。本研究筛选并克隆两个关键基因DlERF10和DlNAC2,从生物信息学角度对其基因结构、蛋白特性及亲缘关系等方面进行了分析,并通过基因工程等手段,进一步深入研究了其在君迁子抗寒中的功能。主要研究结果如下:1.君迁子DlERF10和DlNAC2基因片段长度为1104 bp和801 bp,分别编码367和266个氨基酸,相对分子质量分别为41.48 k Da和30.009 k Da,等电点分别为9.37和8.85,属于亲水性蛋白质,均无信号肽结构域,亚细胞定位预测在细胞核,二级结构和三级结构都主要由无规则卷曲和α-螺旋组成。DlERF10蛋白序列包含一个跨膜结构域和典型的AP2保守结构域,该保守结构域第14和19位氨基酸为丙氨酸和天冬氨酸,表明其属于ERF转录因子家族。DlNAC2蛋白N端有一个高度保守的NAM结构域,该结构域可细分为A、B、C、D、E五个亚结构域。聚类分析发现,DlERF10和DlNAC2与同科同属的油柿和柿子亲缘关系最近,可能具有相似的生物学功能。2.实时荧光定量PCR分析了胁迫处理后DlERF10基因和DlNAC2基因的表达量。结果表明,DlERF10基因和DlNAC2基因在低温、干旱和高盐胁迫后,表达量均发生变化,且随着时间的增加,DlERF10基因和DlNAC2基因的表达量呈现升高趋势。说明DlERF10基因和DlNAC2基因能够受到多个逆境胁迫的诱导表达。3.采用根癌农杆菌介导技术,将DlERF10基因和DlNAC2基因分别导入到烟草中,在进行了抗性筛选和PCR鉴定后,分别得到了2株和32株阳性植株。表达分析显示过表达DlERF10基因的2个阳性株系和过表达DlNAC2基因的4个株系的表达量均高于野生型。4.对野生型烟草和过表达DlERF10和DlNAC2基因烟草植株进行低温胁迫处理,通过观察其表型变化和测定MDA(Malondialdehyde)含量、SOD(Superoxide dismutase)、POD(Peroxidase)和CAT(Catalase)酶活性及PRO(Proline)含量等生理生化指标,比较野生型和转基因烟草对低温的耐受能力。研究发现在低温胁迫处理后,转基因烟草与野生型相比受损程度较轻,且叶片内的抗氧化酶活性(SOD、POD和CAT)和PRO含量增多,MDA含量下降,表明过表达DlERF10基因和DlNAC2基因可以增加抗氧化酶的活性来降低低温胁迫造成的伤害。
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