背景:结肠癌是全球和我国最常见的恶性肿瘤之一,其发病率位居第三位。结肠癌发病隐匿,大多数结肠癌患者在初诊时已经伴随有肿瘤转移。尽管早期手术治疗和放化疗能一定程度治疗和缓解结肠癌,但是对于已经伴有转移或者再复发的结肠癌患者而言,治疗效果并不理想。结肠癌的发病基础十分复杂,导致结肠癌转移的机制更为复杂,对于结肠癌转移的机制研究将为我们靶向治疗结肠癌带来机遇。YAP是Hippo通路下游的主要效应器,在结肠癌中高表达,并且与肿瘤转移程度密切相关。上皮-间质转化使得上皮细胞来源的肿瘤细胞失去细胞极性,获得间质细胞特点,粘附能力下降、迁移能力增加,更易于肿瘤侵袭和转移。现有研究表明,肿瘤上皮-间质转化和肿瘤侵袭转移这一过程均有YAP参与,但其具体分子机制并不明确。因此,对YAP促进结肠癌上皮-间质转化这一分子机制的研究,将有助于我们找到治疗肿瘤侵袭转移的方法,为结肠癌靶向治疗提供新思路。目的:本课题旨在研究YAP促进结肠癌上皮-间质转化的分子机制,为临床上治疗结肠癌寻找新靶点。通过在细胞水平上研究YAP表达对结肠癌EMT的影响以及YAP调控Slug的作用,进一步深入研究YAP调控结肠癌侵袭转移的分子机制。方法:通过免疫组织化学检测临床上收集结肠癌患者癌组织中的YAP表达;用Western blot检测一种组织细胞和四种结肠癌细胞中的YAP表达;采用有限稀释法筛选转染细胞,构建过表达YAP的SW620和HCT116稳转细胞系,用Western blot检测YAP蛋白表达水平,用RT-q PCR检测YAP m RNA水平;细胞划痕实验检测过表达YAP和敲低YAP对不同结肠癌细胞迁移的影响;细胞侵袭实验检测过表达YAP和敲低YAP对不同结肠癌细胞侵袭的影响;Western blot检测过表达YAP和敲低YAP时EMT相关分子的表达变化,明确YAP调控结肠癌细胞EMT的作用;Western blot分别检测瞬转过表达YAP质粒和敲低YAP质粒的结肠癌细胞中与EMT相关的蛋白变化;Western blot分别检测在过表达YAP的稳定细胞系中瞬时转染干扰Slug的si RNA后E-cadherin表达的变化,以及在敲低YAP的稳定细胞系中瞬时转染过表达Slug质粒后E-cadherin表达的变化;q PCR检测YAP不同表达水平下Slug m RNA水平变化;Dual-Luciferase检测在过表达YAP的稳定细胞系中Slug转录活性的变化。设计α=0.05为显著性水平,运用t-检验和方差分析的统计学方法,采用SPSS17.0进行统计分析是否具有显著性差异。结果:免疫组织化学结果显示,与正常结肠黏膜组织相比,YAP在结肠癌组织中的表达明显增加;Western blot结果显示,与其他组织细胞如293T细胞相比,YAP在结肠癌细胞中的表达也明显增加。我们通过有限稀释法挑单克隆已成功筛选出高表达YAP的SW620和HCT116稳转细胞株,用嘌呤霉素筛选两周后获得稳定细胞系,能明显增加YAP蛋白表达水平以及m RNA水平。细胞划痕实验显示过表达YAP能促进结肠癌细胞迁移,敲低YAP能抑制结肠癌细胞迁移;细胞侵袭实验显示过表达YAP能促进结肠癌细胞侵袭,敲低YAP能抑制结肠癌细胞侵袭。在稳定高表达YAP的结肠癌细胞中,Western blot显示与EMT相关的分子E-cadherin表达下调,Slug表达上调;相反在稳定敲低YAP的结肠癌细胞系中,E-cadherin表达上调,Slug表达下调。进一步确认在瞬转过表达YAP质粒的结肠癌SW620细胞中,Slug蛋白的表达水平显著升高,E-cadherin的蛋白表达水平显著降低;在瞬转敲低YAP质粒的结肠癌SW620细胞中,Slug蛋白表达水平显著降低,E-cadherin蛋白表达水平显著升高。另外,Western blot检测发现在过表达YAP的SW620细胞系中瞬转干扰Slug的si RNA后E-cadherin表达回调;在敲低YAP的SW620细胞系中瞬转过表达Slug质粒后E-cadherin表达下调。q PCR检测发现过表达YAP增加Slug m RNA水平,而敲低YAP会降低Slug m RNA水平。Dual-Luciferase检测发现在过表达YAP的SW620细胞系中Slug-Luc启动子的荧光素酶活性明显增加。结论:(1)YAP可以增强结肠癌细胞迁移和侵袭能力。(2)YAP能促进结肠癌细胞EMT。(3)YAP可通过转录激活Slug抑制E-cadherin的表达从而促进结肠癌细胞EMT。