第一部分 急性白血病患者血浆外泌体鉴定并初探其代谢物轮廓及代谢通路[目的]鉴定急性白血病患者血浆中外泌体,初步探索急性白血病患者血浆外泌体的代谢物轮廓及其代谢通路特点。[方法]本研究随访了 2018年3月—2019年3月在苏州大学附属第一医院就诊的初次诊断急性白血病患者71例,包括急性髓系白血病(AML)51例,急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)20例。收集到上述患者治疗前后血浆样本142份,与其匹配的健康供体对照血浆14份。随机选取6名初诊急性白血病患者和4名健康对照,使用外泌体试剂盒提取血浆中外泌体,并通过western-blot蛋白质印迹法(免疫印迹试验)及透射电子显微镜对外泌体进行鉴定。对156份血浆外泌体标本采用气相色谱-质谱联用(GC-MS)代谢组学方法,进行拟靶向代谢物的高通量检测,同时通过计算质量控制样本(QC)的相对标准偏差值(RSD)对样品制备的GC-MS方法学稳定性进行考察。运用自动质谱退卷积定性系统(AMDIS)和美国国家标准与技术研究院(NIST)标准库联合保留指数进行物质鉴定。分别将两种类型患者分为发现组和验证组,其中AML患者发现组包括9例AML患者及6例健康对照,验证组包括42例AML患者及8例健康对照;B-ALL患者发现组包括9例B-ALL患者及6例健康对照,验证组包括1 1例B-ALL患者及8例健康对照。分别对两组发现组运用主成分分析结合偏最小二乘判别法(PLS-DA)筛选不同类型急性白血病患者及健康人群的差异性代谢物;并通过验证组样本结合t检验对发现组样本进行验证,确定有意义的差异代谢物。[结果](1)AL患者和健康人血浆外泌体鉴定。在8例AL患者和4例健康对照中通过westernblot,即外泌体的标记蛋白TSG101、CD63在样本中均检测到,并在电子显微镜下观察到直径30-150nm的囊泡,证明AL患者和健康对照血浆外泌体的存在。(2)血浆外泌体代谢物鉴定。我们通过质量控制(QC)样品检测显示峰面积相对偏差(RSD)<15%的化合物比例达到60%,提示实验数据可靠。满足分析要求。根据AMDIS和NIST标准库和保留指数,总共鉴定到65种代谢物。分别为:异丁酸、异戊酸、丙酮酸、乳酸、己酸、乙醇酸、2-甲基己酸、丙氨酸、缬氨酸、肌氨酸、草酸、3-羟基丙酸、亮氨酸、3-羟基丁酸、缬氨酸、尿素、D-来苏糖、磷酸、甘油、脯氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、琥珀酸、甲基丁二酸、富马酸、丝氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、苹果酸、高脯氨酸、焦谷氨酸、天冬氨酸、羟脯氨酸、半胱氨酸、苏糖氨酸、苯丙氨酸、木糖醇、谷氨酰胺、鸟氨酸、柠檬酸、d-塔格糖、N-α-乙酰-L-赖氨酸、D-果糖、酪氨酸、阿洛糖、葡萄糖、半乳糖、软脂酸、肌醇、十八碳二烯酸、十八碳烯酸、亚油酸、硬脂酸、6-磷酸葡萄糖、花生四烯酸、肉豆蔻酸、肌醇、2-棕榈酰甘油、二十二碳四烯酸、单棕榈酸甘油酯、D-蔗糖、麦芽糖、单硬脂酸甘油酯、α-酮戊二酸和胆固醇。(3)AL患者和健康对照代谢轮廓分析。采用主成分分析、PLS-DA和t检验方法,我们发现AL患者与健康对照代谢轮廓有明显差异(p<0.05)。通过AL患者治疗前和健康对照样本构成的发现组与验证组筛选,从AML患者中验证出了 16种代谢物:丙酮酸、乳酸、缬氨酸、尿素、脯氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、高脯氨酸、焦谷氨酸、苏糖氨酸、苯丙氨酸、鸟氨酸、柠檬酸、d-塔格糖、N-α-乙酰-L-赖氨酸表达量均有明显下降(p<0.05);同时比较了治疗前后代谢物表达量的变化,丙酮酸、柠檬酸、塔格糖和赖氨酸的总体水平在治疗后是降低的,其余物质无明显变化。B-ALL组中验证出1 1种代谢物质缬氨酸、尿素、甘油、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、高脯氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、鸟氨酸和肌醇明显升高(p<0.05);其治疗后与治疗前比较,治疗后肌醇表达明显下降,其他物质无明显差异。(4)AL代谢通路分析。AL差异性代谢物所涉及代谢通路通过MetPA网络分析提示,AML患者外泌体的代谢紊乱主要与氨酰基-tRNA的生物合成、柠檬酸循环、丙氨酸,天冬氨酸和谷氨酸代谢、丙酮酸代谢、甘氨酸,丝氨酸和苏氨酸代谢密切相关(p<0.05,impact>0.1),其次糖酵解/糖异生、甘油脂代谢、苯丙氨酸代谢、苯丙氨酸,酪氨酸和色氨酸的生物合成也有联系;B-ALL患者外泌体的代谢紊乱主要涉及糖酵解/糖异生、氨酰基-tRNA的生物合成、柠檬酸循环、乙醛酸酯和二羧酸酯、丙氨酸,天冬氨酸和谷氨酸代谢、丙酮酸代谢、甘氨酸,丝氨酸和苏氨酸的代谢(p<0.05,impact>0.1),而与谷胱甘肽代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢、磷酸肌醇代谢、甘油脂代谢、苯丙氨酸代谢、苯丙氨酸,酪氨酸和色氨酸的生物合成也有一定的联系(impact>0.1)。[结论]急性白血病患者血浆中的外泌体代谢轮廓与健康人存在差异,AML和ALL血浆的外泌体代谢轮廓和代谢通路亦存在差异。第二部分 探讨急性白血病患者血浆外泌体代谢物与临床特征的相关性,及其在疗效及预后中的临床意义[目的]探讨急性白血病(AL)患者血浆外泌体中差异性代谢物与临床特征的相关性,进一步评估差异性代谢物在AL患者疗效及预后中的临床意义。[方法]我们对初诊71例患者进行随访,所有患者均接受1-2疗程诱导化疗,并进行了2-4疗程巩固,完善骨髓细胞形态学、免疫分型、染色体、基因突变(MICM)等临床资料,并在随访终点根据治疗前后的物质变化评估其疗效及生存预后。采用的GC-MS技术方法,样本以及物质鉴定同第一部分。结合临床资料,将51例AML患者和20例B-ALL患者分别与对应临床因素进行斯皮尔曼等级相关分析(Spearman)和曼-惠特尼U检验,找出与临床因素有关的具有诊断或预测意义的差异代谢物。采用Kaplan-Meier生存分析方法对所有患者临床特征和标志性代谢物对生存影响进行对数秩检验(log rank test)单因素分析,最后将对生存有影响的代谢物与临床指标纳入COX比例风险模型进行多因素分析,找到影响生存的标志性代谢物。[结果](1)AL患者临床疗效和预后。71例患者的中位随访时间为11.63(1.17-20.9)月。其中51例AML患者的中位随访时间为11.57(1.17-20.47)月,均经1-2疗程诱导化疗,1疗程诱导化疗后达到缓解38例,未缓解13例,2疗程诱导化疗达到缓解48例,持续未缓解3例;至随访终点,持续缓解33例,复发11例,死亡13例(包括复发后死亡6例),累计复发率(CRR)为39.66%,总体生存率(OS)率为70.24%,无进展生存(PFS)率为60.34%;20例B-ALL患者中位随访时间为12.43(2.87-20.9)月,1疗程诱导化疗后达到缓解16例,未缓解4例;2疗程诱导化疗后达到缓解20例;至随访终点,持续缓解19例,复发3例,死亡0例,累计复发率为15%,无进展生存(PFS)率为85%;(2)AL患者血浆外泌体代谢物与临床特征的相关性。在51例AML患者中,包括5例M1、21例M2、6例M3、10例M4、9例M5;免疫分型表达CD117+34例,阴性17例;CD13+41例,阴性10例;CD33+42例,阴性9例;DR+16例,阴性35例;基因突变中发生JAK2+2例;FLT3+20例;CEBPa双突变10例;NRAS+8例等。20 例 B-ALL 中,6 例 ph-B-ALL、13 例 ph+B-ALL、1 例 phlike-B-ALL;表达CD10有16例,4例阴性;CD19阳性17例,3例阴性;CD20阳性6例,14例阴性;融合基因EVI1高表达(>250copies)3例,低表达17例。基因突变FLT3突变2例;TP53突变1例。采用独立样本的曼-惠特尼秩和U检验进行临床因素与代谢差异物相关性分析,发现AML中CEBPA基因双突变与异亮氨酸升高有关,NRAS基因突变与丝氨酸降低有关。B-ALL中EVI1融合基因高表达与异亮氨酸及苏氨酸升高有关。(3)AL患者治疗前后血浆外泌体代谢物的变化与预后的相关性。根据第一部分筛选出的差异代谢物,我们选取同一患者治疗后/治疗前比值代谢变化分析预后。通过治疗前后配对t检验,发现AML缓解组中,治疗后塔格糖(P=0.012)显著降低,而在未缓解组中柠檬酸降低有显著差异(P=0.026),其他物质未见明显差异(P>0.05)。在B-ALL患者缓解组中,治疗后肌醇显著降低(P=0.016),而在未缓解组未观察到物质在治疗前后的差异性变化(P>0.05)。对AML组进行单因素生存分析即Kaplan-Meier 生存分析,发现临床因素中 WT1+(>200 copies)、MYC、RUNX1、PTPN 及BCORL1影响患者OS(p<0.05),差异代谢物中:丙酮酸、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸及鸟氨酸治疗后/治疗前高比值对总生存期有一定的影响(p<0.1),单因素纳入Cox回归模型表明血浆外泌体中丙酮酸,丝氨酸和鸟氨酸治疗后/治疗前高比值可能是影响AML患者OS的独立危险因素。同时使用ROC检测及leave-one-out交叉验证对上述结果进行检验,发现丙酮酸(AUC=0.744,p=0.009)和丝氨酸(AUC=0.710,p=0.025)治疗后/治疗前高比值代谢变化指标可能具有更好的预后预测价值。临床因素中免疫表型 CD33、MYC、DNMT3A、RUNX1、PTPN、CEBPA 及 BCORL1 可影响患者的PFS(p<0.1),差异代谢物中:丙酮酸、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、鸟氨酸及赖氨酸治疗后/治疗前高比值对PFS有影响(p<0.1),单因素纳入Cox回归模型发现治疗后/治疗前高比值的丝氨酸和鸟氨酸更有可能经历疾病进展,因此丝氨酸和鸟氨酸治疗后/治疗前高比值可能是影响AML患者PFS的独立危险因素。leave-one-out交叉验证及ROC检测模型预测效果不显著(AUC<0.7,p>0.05)。在20例B-ALL中,至随访终点无死亡,故单独分析PFS,单因素生存分析发现临床因素CD7、CD25及BCORL1与B-ALL患者的PFS有关,而差异代谢物天门冬氨酸代谢对PFS有影响(p<0.1),将单因素纳入Cox回归模型显示无明显差异。[结论]AL患者血浆外泌体代谢物与临床特征存在一定的相关性,并且丙酮酸、丝氨酸和鸟氨酸治疗后/治疗前高比值代谢变化是AML患者OS的独立危险因素,治疗后/治疗前高比值的丝氨酸和鸟氨酸对OS的预测效果更好;丝氨酸和鸟氨酸治疗后/治疗前高比值代谢变化也是AML患者PFS的独立危险因素。