【摘 要】
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TBC(Tre-2/Bub2/Cdc16)域家族都是高度保守的蛋白,具有很高的同源性,TBC1D15 是TBC 家族的成员,具有特定的Rab-GAP 活性,已在鼠,人等五种中有所报道,但是其在鲨鱼中的报道至今较少。本实验主要研究条纹斑竹鲨中TBC1D15 的对Rab 蛋白的底物专一性及某些保守氨基酸位点突变后对其Rab-GAP 活性功能的影响；并与猪,人中的TBC1D15 相比较,以分析出决定TB
【机 构】
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浙江理工大学生命科学学院,杭州,310018;浙江省家蚕生物反应器和生物医药重点实验室,杭州310000
【出 处】
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中国生物化学与分子生物学会2016年全国学术会议
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TBC(Tre-2/Bub2/Cdc16)域家族都是高度保守的蛋白,具有很高的同源性,TBC1D15 是TBC 家族的成员,具有特定的Rab-GAP 活性,已在鼠,人等五种中有所报道,但是其在鲨鱼中的报道至今较少。本实验主要研究条纹斑竹鲨中TBC1D15 的对Rab 蛋白的底物专一性及某些保守氨基酸位点突变后对其Rab-GAP 活性功能的影响；并与猪,人中的TBC1D15 相比较,以分析出决定TBC1D15的物种进化性的关键氨基酸。方法：通过序列比对软件Bioedit对shark,sus,mus,homo 四个物种TBC1D15 的氨基酸序列进行比对,寻找保守氨基酸变异位点。利用生物软件MEGA6对不同物种的TBC1D15 构建进化树,分析不同物种在TBC1D15 进化上的远近关系,挑选出进化关系相对较远的三个物种：shark,sus,homo 进行进一步分析。定点突变将shark,sus,ho的mo保守氨基酸变异位点进行相互回复突变。利用基因工程的方法构建重组质粒pETduet-His-Sumo-shark-TBC1D1 5；pETduet-His-Sumo-sus-TBC1D15；pETduet-His-Sumo-homo-TBC1D15及pETduet-His-Sumo-Rab4/5/7/81/0/11,并进行原核表达,纯化出一定纯度和浓度的蛋白。最后进行Rab-GAP 特异性分析：利用试剂盒EnzChek(R) PhosphateAssay Kit,通过检测Pi 含量的释放来研究TBC1D15与Rab 系列蛋白的相互作用情况。结果：条纹斑竹鲨与猪,人相比较为低等,其TBC1D15 与Rab 蛋白相互作用时底物专一性不强,与Rab4/5/7/8/10/1皆1 有一定程度的作用,且与Rab11作用最明显。而猪,人的进化程度相对较高,与Rab4/5/7/8/10/11 相互作用时底物专一性较强：pETduet-His-Sumo-sus-TBC1D15 与Rab7 和11 有相互作用,而pETduet-His-Sumo-homo-TBC1D15 仅与Rab7 相互作用。将保守氨基酸不同的位点相互突变后,shark-TBC1D15 的底物专一性有所增强,不能作用于所有的Rab,而homo-TBC1D15 的保守氨基酸位点突变为shark-TBC1D15 该位置对应的氨基酸后,专一性明显减弱,能作用于Rab7,11等蛋白。结论：TBC1D15 在进化过程中很保守,尤其是精氨酸。但是从鲨鱼到猪,人,仍有一些精氨酸的改变,将这些保守氨基酸突变后发现不同物种的TBC1D15 对Rab 蛋白的底物专一性有所变化,由此可以看出这些精氨酸可能是决定shark-TBC1D15 进化过程中底物专一性的关键氨基酸,突变后导致对Rab 蛋白相互作用的变化。该研究对更深入的了解TBC1D15 结构及其进化具有重要意义。
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