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摘要：目的 建立通窍鼻渊丸（浓缩丸）的质量控制方法。方法 采用薄层色谱法对方中栀子、麻黄、川芎药材进行定性鉴别。采用高效液相色谱法对方中栀子的有效成分栀子苷进行含量测定。结果 定性鉴别色谱特征明显。方法学考察表明，栀子苷进样量在0.162 4～1.624 ?g范围内线性关系良好，r=0.999 4，平均加样回收率为98.26% （RSD=2.83%，n=5）。结论 本方法简便、可靠、专属性强、重复性好，可用于通窍鼻渊丸的质量控制。
关键词：通窍鼻渊丸；薄层色谱法；高效液相色谱法；栀子苷；质量标准
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2012.03.018
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）03-0047-03
通窍鼻渊丸是甘肃省中医院院内制剂，由栀子、麻黄、川芎、辛夷、葛根等15味药组成，具有祛风通窍、清热止痛的功效，对鼻炎、鼻窦炎所致的头痛、流黄稠涕、鼻塞等症具有良好的作用。栀子为方中君药，其所含的水溶性成分栀子苷具有显著的药理作用[1-3]。本试验采用薄层色谱法（TLC）对方中的麻黄、川芎、栀子进行定性鉴别，采用高效液相色譜法（HPLC）对栀子中的栀子苷进行含量测定，旨在为该产品的质量控制提供客观的定性定量评价方法。
1 仪器与试药
高效液相色谱仪（美国Waters 2695，包括Waters2487双通道紫外检测器），电子天平（Sartorius R-200D德国），GOOD LOOK-1000型薄层色谱成像系统；电热套（HM500型，北京科伟仪器公司）；超声波清洗器（KQ-2500DE，昆山超声仪器有限公司）；HHS数显恒温水浴锅、Y-308B小型粉碎机；全自动速控中药制丸机（TYPE-YUG101型，甘肃天水华圆制药设备有限公司）；微波真空干燥仪（甘肃天水华圆制药设备有限公司）。
栀子苷对照品（批号110749-200714）、麻黄碱对照品（批号0714-9903）、川芎对照药材（批号110736-200424）、栀子对照药材（批号120986-200703）、麻黄对照药材（批号10514-
200202）均购自中国药品生物制品检定所；甲醇（批号20100410，天津市科米欧化学试剂开发中心）为色谱纯；乙腈（批号20100410，天津市科米欧化学试剂开发中心）为色谱纯；薄层用硅胶G（批号20100212，中国青岛海洋化工）；薄层用硅胶GF254（批号20090812，中国青岛海洋化工）；水为纯净水；其他试剂为分析纯。
2 方法与结果
2.1 定性鉴别
2.1.1 川芎 取本品粉末及缺川芎阴性粉末各6 g，加石油醚（60～90 ℃）40 mL，超声处理30 min，滤过，药渣备用。滤液分别蒸干，残渣各加乙酸乙酯1 mL溶解，得供试品溶液及缺川芎阴性对照溶液。另取川芎对照药材1 g，加石油醚（60～90 ℃）10 mL，超声处理10 min，滤过，滤液作为对照药材溶液。取上述3种溶液各5 ?L，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯（10∶1）为展开剂展开，晾干，置紫外灯（254 nm）下检视。在与川芎对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
2.1.2 栀子 取“2.1.1”项下的药渣，挥尽石油醚，加乙酸乙酯40 mL，水浴70 ℃回流1 h，放冷，滤过，滤液蒸干，加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。取栀子对照药材1 g，缺栀子阴性对照品6 g，同法制成栀子对照药材溶液及缺栀子阴性对照溶液。再取栀子苷对照品，加甲醇制成4 mg/mL的对照品溶液。取上述4种溶液各5 ?L，分别点与同一硅胶G板，三氯甲烷-甲醇（3∶1）为展开剂展开，取出晾干，喷以10%硫酸乙醇试液， 105 ℃加热至斑点清晰。供试品色谱中，在与栀子苷对照品及栀子对照药材色谱相应的位置显相同颜色的斑点。
2.1.3 麻黄 取本品粉末4 g，加浓氨试液1 mL，三氯甲烷30 mL，超声处理15 mL，放冷滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。取麻黄对照药材1 g，缺麻黄阴性粉末4 g，同法制成麻黄对照药材溶液及阴性对照溶液。再取麻黄碱对照品加甲醇制成1 mg/mL的照品溶液。取上述4种溶液各10 ?L，分别点与同一硅胶G板，以三氯甲烷-甲醇-浓氨试液（20∶4∶0.2）为展开剂展开，取出晾干，喷以茚三酮试液，105 ℃加热至斑点清晰。供试品色谱中，在与麻黄碱对照品、麻黄对照药材相应的位置有相同颜色的斑点。
2.2 栀子苷含量测定
2.2.1 色谱条件 色谱柱Symmetryshied RP18（5 ?m，4.6 mm×250 mm）；流动相：乙腈-水（13∶87）；流速：1 mL/min；检测波长：238 nm；进样量10 ?L；柱温：25 ℃。在选定色谱条件下，理论塔板数以栀子苷峰计算大于5 000，阴性无干扰。
2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取栀子苷对照品8.12 mg，置50 mL容量瓶中，用CH3OH稀释并定容至刻度，得栀子苷含量为0.162 4 mg/mL的对照品储备液，精密量取对照品储备液1、2、4、6、8、10 mL置10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，得到系列浓度（16.24、32.48、64.96、97.44、129.92、162.40 ?g/mL）的对照品甲醇溶液。
2.2.3 供试品溶液的制备 精密称取本品粉末4 g，置具塞锥形瓶中精密加入甲醇25 mL，称定重量，超声处理（功率300 W，频率25 kHz）20 min，放冷；再称定重量，补足重量，摇匀，滤过；精密量取续滤液10 mL，置25 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，过0.45 ?m微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。 2.2.4 阴性对照品溶液的制备 取缺栀子阴性对照粉末4 g，按“2.2.2”项下方法制成缺栀子阴性对照品溶液。
2.3 方法学考察
2.3.1 阴性干扰试验 分别吸取栀子苷对照品（32.48 ?g/mL）溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液各10 ?L，按上述色谱条件分别进样测定，并记录色谱图。结果显示，阴性对照品溶液对测定结果无干扰。见图1。
2.3.2 线性范围的考察 精密吸取不同浓度的栀子苷对照品溶液10 ?L，分别进样，按前述色谱条件测定峰面积，以峰面积对栀子苷进样量（?g）进行线性回归，得回归方程Y=11 288.041X-13 128.332，r=0.999 4，结果表明，栀子苷进样量在0.162 4～1.624 ?g之间呈良好的线性关系。
2.3.3 精密度试验 用同一供试品溶液连续进样6次，每次10 ?L，分别测定峰面积。结果栀子苷的RSD=0.27%（n=6），表明仪器精密度好。
2.3.4 重复性试验 取同一批样品，按供试品溶液制备方法平行制备溶液6份，依法测定，结果栀子苷的RSD=2.9%（n=6），表明本法重复性良好。
图1 通窍鼻渊丸HPLC图
2.3.5 稳定性试验 取同一供试品的溶液，分别于0、3、6、9、12 h时依法测定。结果栀子苷的峰面积无显著变化，RSD=3.1%（n=5），表明供试品溶液至少在12 h内稳定。
2.3.6 加样回收率试验 精密称取已知含量的样品6份，分别精密加入已知含量的对照品溶液，按供试品溶液制备方法制备供试液，依法进行含量测定并计算回收率。结果见表1。
2.3.7 样品含量测定 按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，测定3批样品的栀子苷含量，结果见表2。
3 讨论
栀子苦、寒，归心、肺、三焦经[4]，具有泻火除烦、利湿解毒之功效。通窍鼻渊丸中栀子用量为30 g，是其他药味用量的1.2倍。本试验参考文献[5-7]，用HPLC对栀子中的栀子苷做了含量测定，结果表明，方法简便准确，重复性好，可有效控制产品质量。
麻黄的薄层色谱在预试验中考察了提取方法和展开系统。提取步骤考察了乙醚、三氯甲烷、乙酸乙酯3种溶剂的提取效果，回流与超声处理的对比；展开系统考察了正丁醇-冰醋酸-水系统及三氯甲烷-甲醇-浓氨试液系统，经多次优化，选择三氯甲烷-浓氨试液（30∶1）提取，三氯甲烷-甲醇-浓氨试液（20∶4∶0.2）为展开系，效果理想，重复性好。显色剂茚三酮试液配好后，应不超过24 h，并且用滤纸过滤。
在供试品溶液制备过程中，参照文献[4-5]，对提取溶剂经行了筛选，分别采用甲醇和流动相（乙腈∶水=13∶87）作为溶媒进行提取。结果发现，选甲醇作为提取溶媒时，分离效果好。对提取时间的考察超声处理5、10、20、30、40 min，测定结果显示，20～40 min含量无明显变化，表明超声处理20 min溶出也达到平衡，故定为样品处理方法。
参考文献：
[1] 姚宗玲，陆洋，杜守颖，等.醒脑静滴鼻液中栀子苷家兔体内药动学研究[J].中国中药杂志，2010，35（14）：1872.
[2] Choi HJ， Park YS， Kim MG， et al. Isolation and characterization of the major colorant in Gardenia fruit[J]. Dyes Pigm，2001， 49（1）：15-20.
[3] 李保华，栀子的研究概况[J].时珍国医国药，2008，15（6）：370.
[4] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：231-232.
[5] 陈阳，赵璨，张浩，等.栀子黄OD值、色价与西红花苷和栀子苷的相关性研究[J].食品科技，2010，35（5）：262-265.
[6] Militao GC， Ferreira PM， Freitas RM. Effects of lipoic acid on oxidative stress in rat striatum after pilocarpine induced seizures[J]. Neurochem Int，2010，56（1）：16-20.
[7] 陳芳，董志，傅亚.栀子总环稀醚萜苷纯化工艺研究[J].激光杂志，2010， 31（2）：95-96.
（收稿日期：2011-05-24，编辑：陈静）
关键词：通窍鼻渊丸；薄层色谱法；高效液相色谱法；栀子苷；质量标准
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2012.03.018
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）03-0047-03
通窍鼻渊丸是甘肃省中医院院内制剂，由栀子、麻黄、川芎、辛夷、葛根等15味药组成，具有祛风通窍、清热止痛的功效，对鼻炎、鼻窦炎所致的头痛、流黄稠涕、鼻塞等症具有良好的作用。栀子为方中君药，其所含的水溶性成分栀子苷具有显著的药理作用[1-3]。本试验采用薄层色谱法（TLC）对方中的麻黄、川芎、栀子进行定性鉴别，采用高效液相色譜法（HPLC）对栀子中的栀子苷进行含量测定，旨在为该产品的质量控制提供客观的定性定量评价方法。
1 仪器与试药
高效液相色谱仪（美国Waters 2695，包括Waters2487双通道紫外检测器），电子天平（Sartorius R-200D德国），GOOD LOOK-1000型薄层色谱成像系统；电热套（HM500型，北京科伟仪器公司）；超声波清洗器（KQ-2500DE，昆山超声仪器有限公司）；HHS数显恒温水浴锅、Y-308B小型粉碎机；全自动速控中药制丸机（TYPE-YUG101型，甘肃天水华圆制药设备有限公司）；微波真空干燥仪（甘肃天水华圆制药设备有限公司）。
栀子苷对照品（批号110749-200714）、麻黄碱对照品（批号0714-9903）、川芎对照药材（批号110736-200424）、栀子对照药材（批号120986-200703）、麻黄对照药材（批号10514-
200202）均购自中国药品生物制品检定所；甲醇（批号20100410，天津市科米欧化学试剂开发中心）为色谱纯；乙腈（批号20100410，天津市科米欧化学试剂开发中心）为色谱纯；薄层用硅胶G（批号20100212，中国青岛海洋化工）；薄层用硅胶GF254（批号20090812，中国青岛海洋化工）；水为纯净水；其他试剂为分析纯。
2 方法与结果
2.1 定性鉴别
2.1.1 川芎 取本品粉末及缺川芎阴性粉末各6 g，加石油醚（60～90 ℃）40 mL，超声处理30 min，滤过，药渣备用。滤液分别蒸干，残渣各加乙酸乙酯1 mL溶解，得供试品溶液及缺川芎阴性对照溶液。另取川芎对照药材1 g，加石油醚（60～90 ℃）10 mL，超声处理10 min，滤过，滤液作为对照药材溶液。取上述3种溶液各5 ?L，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯（10∶1）为展开剂展开，晾干，置紫外灯（254 nm）下检视。在与川芎对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
2.1.2 栀子 取“2.1.1”项下的药渣，挥尽石油醚，加乙酸乙酯40 mL，水浴70 ℃回流1 h，放冷，滤过，滤液蒸干，加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。取栀子对照药材1 g，缺栀子阴性对照品6 g，同法制成栀子对照药材溶液及缺栀子阴性对照溶液。再取栀子苷对照品，加甲醇制成4 mg/mL的对照品溶液。取上述4种溶液各5 ?L，分别点与同一硅胶G板，三氯甲烷-甲醇（3∶1）为展开剂展开，取出晾干，喷以10%硫酸乙醇试液， 105 ℃加热至斑点清晰。供试品色谱中，在与栀子苷对照品及栀子对照药材色谱相应的位置显相同颜色的斑点。
2.1.3 麻黄 取本品粉末4 g，加浓氨试液1 mL，三氯甲烷30 mL，超声处理15 mL，放冷滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。取麻黄对照药材1 g，缺麻黄阴性粉末4 g，同法制成麻黄对照药材溶液及阴性对照溶液。再取麻黄碱对照品加甲醇制成1 mg/mL的照品溶液。取上述4种溶液各10 ?L，分别点与同一硅胶G板，以三氯甲烷-甲醇-浓氨试液（20∶4∶0.2）为展开剂展开，取出晾干，喷以茚三酮试液，105 ℃加热至斑点清晰。供试品色谱中，在与麻黄碱对照品、麻黄对照药材相应的位置有相同颜色的斑点。
2.2 栀子苷含量测定
2.2.1 色谱条件 色谱柱Symmetryshied RP18（5 ?m，4.6 mm×250 mm）；流动相：乙腈-水（13∶87）；流速：1 mL/min；检测波长：238 nm；进样量10 ?L；柱温：25 ℃。在选定色谱条件下，理论塔板数以栀子苷峰计算大于5 000，阴性无干扰。
2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取栀子苷对照品8.12 mg，置50 mL容量瓶中，用CH3OH稀释并定容至刻度，得栀子苷含量为0.162 4 mg/mL的对照品储备液，精密量取对照品储备液1、2、4、6、8、10 mL置10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，得到系列浓度（16.24、32.48、64.96、97.44、129.92、162.40 ?g/mL）的对照品甲醇溶液。
2.2.3 供试品溶液的制备 精密称取本品粉末4 g，置具塞锥形瓶中精密加入甲醇25 mL，称定重量，超声处理（功率300 W，频率25 kHz）20 min，放冷；再称定重量，补足重量，摇匀，滤过；精密量取续滤液10 mL，置25 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，过0.45 ?m微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。 2.2.4 阴性对照品溶液的制备 取缺栀子阴性对照粉末4 g，按“2.2.2”项下方法制成缺栀子阴性对照品溶液。
2.3 方法学考察
2.3.1 阴性干扰试验 分别吸取栀子苷对照品（32.48 ?g/mL）溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液各10 ?L，按上述色谱条件分别进样测定，并记录色谱图。结果显示，阴性对照品溶液对测定结果无干扰。见图1。
2.3.2 线性范围的考察 精密吸取不同浓度的栀子苷对照品溶液10 ?L，分别进样，按前述色谱条件测定峰面积，以峰面积对栀子苷进样量（?g）进行线性回归，得回归方程Y=11 288.041X-13 128.332，r=0.999 4，结果表明，栀子苷进样量在0.162 4～1.624 ?g之间呈良好的线性关系。
2.3.3 精密度试验 用同一供试品溶液连续进样6次，每次10 ?L，分别测定峰面积。结果栀子苷的RSD=0.27%（n=6），表明仪器精密度好。
2.3.4 重复性试验 取同一批样品，按供试品溶液制备方法平行制备溶液6份，依法测定，结果栀子苷的RSD=2.9%（n=6），表明本法重复性良好。
图1 通窍鼻渊丸HPLC图
2.3.5 稳定性试验 取同一供试品的溶液，分别于0、3、6、9、12 h时依法测定。结果栀子苷的峰面积无显著变化，RSD=3.1%（n=5），表明供试品溶液至少在12 h内稳定。
2.3.6 加样回收率试验 精密称取已知含量的样品6份，分别精密加入已知含量的对照品溶液，按供试品溶液制备方法制备供试液，依法进行含量测定并计算回收率。结果见表1。
2.3.7 样品含量测定 按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，测定3批样品的栀子苷含量，结果见表2。
3 讨论
栀子苦、寒，归心、肺、三焦经[4]，具有泻火除烦、利湿解毒之功效。通窍鼻渊丸中栀子用量为30 g，是其他药味用量的1.2倍。本试验参考文献[5-7]，用HPLC对栀子中的栀子苷做了含量测定，结果表明，方法简便准确，重复性好，可有效控制产品质量。
麻黄的薄层色谱在预试验中考察了提取方法和展开系统。提取步骤考察了乙醚、三氯甲烷、乙酸乙酯3种溶剂的提取效果，回流与超声处理的对比；展开系统考察了正丁醇-冰醋酸-水系统及三氯甲烷-甲醇-浓氨试液系统，经多次优化，选择三氯甲烷-浓氨试液（30∶1）提取，三氯甲烷-甲醇-浓氨试液（20∶4∶0.2）为展开系，效果理想，重复性好。显色剂茚三酮试液配好后，应不超过24 h，并且用滤纸过滤。
在供试品溶液制备过程中，参照文献[4-5]，对提取溶剂经行了筛选，分别采用甲醇和流动相（乙腈∶水=13∶87）作为溶媒进行提取。结果发现，选甲醇作为提取溶媒时，分离效果好。对提取时间的考察超声处理5、10、20、30、40 min，测定结果显示，20～40 min含量无明显变化，表明超声处理20 min溶出也达到平衡，故定为样品处理方法。
参考文献：
[1] 姚宗玲，陆洋，杜守颖，等.醒脑静滴鼻液中栀子苷家兔体内药动学研究[J].中国中药杂志，2010，35（14）：1872.
[2] Choi HJ， Park YS， Kim MG， et al. Isolation and characterization of the major colorant in Gardenia fruit[J]. Dyes Pigm，2001， 49（1）：15-20.
[3] 李保华，栀子的研究概况[J].时珍国医国药，2008，15（6）：370.
[4] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：231-232.
[5] 陈阳，赵璨，张浩，等.栀子黄OD值、色价与西红花苷和栀子苷的相关性研究[J].食品科技，2010，35（5）：262-265.
[6] Militao GC， Ferreira PM， Freitas RM. Effects of lipoic acid on oxidative stress in rat striatum after pilocarpine induced seizures[J]. Neurochem Int，2010，56（1）：16-20.
[7] 陳芳，董志，傅亚.栀子总环稀醚萜苷纯化工艺研究[J].激光杂志，2010， 31（2）：95-96.
（收稿日期：2011-05-24，编辑：陈静）