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摘要:目的 研究具有益气解毒功效的牛黄参(牛黄、西洋参)含药血清对大鼠肝卵圆细胞系WB-F344诱导分化及增殖的影响,探讨其作用机制。方法 用不同浓度的牛黄参含药血清(5%、10%、20%)作用于WB-F344细胞,以正常大鼠血清(5%、10%、20%)处理的WB-F344为空白组,以单纯培养体系处理的WB-F344为正常组。四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测细胞的增殖情况,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测WB-F344肝干细胞表面标志物甲胎蛋白(AFP)和肝白蛋白(ALB)mRNA表达情况。结果 经具有益气解毒功效的牛黄参含药血清干预后,MTT结果显示,10%、20%浓度的牛黄参含药血清能促进WB-F344的增殖(P<0.01),且10%为增殖的最佳浓度梯度;RT-PCR结果显示,经10%牛黄参含药血清处理的WB-F344细胞AFP mRNA的表达随时间的延长逐渐下降(P<0.01),而ALB mRNA的表达则逐渐升高(P<0.01)。结论 益气解毒中药可诱导WB-F344细胞向肝细胞特性方向的分化,可促进WB-F344细胞的增殖,这可能是其抗肝损伤、促进肝再生的机制之一。
关键词;益气解毒法;含药血清;肝卵圆细胞;WB-F344细胞;大鼠
中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1005-5304(2012)07-0031-03
目前,治疗肝衰竭最有效的方法是肝移植,然而供肝来源缺乏,仅有少数患者可以得到肝移植的机会。肝干细胞是体内存在的一种具有自我增殖能力和多向分化潜能的干细胞,可以分化为肝细胞和胆管上皮细胞等多种细胞。近年来,人们发现肝干细胞可参与肝脏的修复与重建,是肝细胞移植、生物人工肝的重要细胞来源,对急慢性肝病有明确的治疗作用,使肝干细胞的研究成为热点[1-2]。
WB-F344细胞是从成年雄性大鼠肝脏中分离得到的成体干细胞株,是大鼠肝卵圆细胞系,具有生物学特性稳定、易于体外培养等优点[3]。我们以细胞体外培养模型,观察具有益气养阴、清热解毒之功的牛黄参(牛黄、西洋参)含药血清对大鼠肝卵圆细胞系WB-F344增殖的影响及分化刺激的作用,探讨益气解毒中药调控肝干细胞的机理,为进一步揭示益气解毒法诱导肝干细胞的分化及其机制提供依据。
1 实验材料
1.1 动物与细胞
48只SPF级雄性Wistar大鼠,体质量180~200 g,湖北省实验动物研究中心提供,许可证号SCXK(鄂)2008-0005。WB-F344细胞购自上海复祥生物科技有限公司。
1.2 药物与试剂
体外培育牛黄、西洋参、牛黄参胶囊均由武汉健民大鹏药业有限公司提供。无菌磷酸盐缓冲液(武汉博士德生物工程有限公司);DMEM高糖液体培养基(HYCLONE,批号NWH0459);10%灭活的特优级胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司,批号110629);四甲基偶氮唑盐(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、胰蛋白酶均为美国GIBCO公司分装;Trizol(总RNA抽提试剂,碧云天生物技术研究所生产,批号120016);上、下游引物(BIONEER);Fermentas反转录试剂盒(美国MBI,货号00074555);肝细胞生长因子(HGF)、表皮细胞生长因子(EGF),美国派普泰克公司;青霉素、链霉素双抗(西化仪北京科技有限公司,批号20100925);地塞米松磷酸钠注射液(湖北天药药业股份有限公司,批号20100911);胰岛素(安徽宏业药业有限公司,批号20101101);氯仿(批号20110337)、无水乙醇(批号20110644)、异丙醇(批号20110215)、苯酚(批号20100429)均购自国药集团化学试剂有限公司。
1.3 仪器
CA-1800超净工作台(上海净化设备有限公司),BS60三用恒温水浴箱(北京医疗设备厂),RT-6500酶标仪(深圳雷杜生命科学股份有限公司),MCO-175二氧化碳培养箱(日本三洋公司),BG-QSPIN手掌型离心机(北京百晶生物技术有限公司),YX-280A不锈钢手提式消毒器(上海博迅实业有限公司),CK2-TR倒置显微镜(日本奥林巴斯),FORMA-725超低温冰箱(FORMA SCIENTIFIC公司),AJY-6000-U纯水器(重庆颐洋企业有限公司),ZEISS过滤器(德国蔡司),BP211D精密电子天平(德国赛多利斯),SUV2120紫外/可见分光光度计(韩国MECASYS公司),DYCZ-20A电泳槽(北京六一仪器厂),DYY-12电泳仪(北京六一仪器厂),GL-21B高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂),紫外透射反射分析仪(上海顾村电光仪器厂),凝胶图像分析仪(武汉千屏影像技术有限公司),PCR测定仪(美国BIO-RAD公司)。
2 实验方法
2.1 含药血清的制备
体外培育牛黄、西洋参配伍组(1∶6)采用传统水煎法灌胃动物制备含药血清(简称水煎组);依据现代药理药效研究,提取西洋参、牛黄中的有效成分制成牛黄参胶囊,然后胶囊取粉稀释使用,灌胃动物制作含药血清(简称成分组)。将大鼠分为空白组、水煎组、成分组,每组各16只。给药组以相应的药物连续灌胃,1次/d,含牛黄原药材浓度3.6 g/L,含西洋参原药材浓度21.6 g/L,大鼠按体质量100 g灌胃1 mL的量给药;空白组灌胃等量的生理盐水。连续1周,末次给药后2 h进行大鼠颈动脉取血,将采集的血液在室温中静置4 h,3 000 r/min离心15 min,将收集的血清在56 ℃水浴30 min进行灭活,而后过滤除菌,分装成小瓶,于-20 ℃保存备用,需要时用培养液配制成不同浓度含药血清。
2.2 细胞培养
用50 mL培养瓶,将WB-F344细胞接种于含10%胎牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺、100 U/mL青霉素及链霉素的高糖DMEM培养基中,细胞浓度为2×104个/mL,置于5%CO2、37 ℃培养箱中培养。细胞换液时间为2~3 d,3~5 d传代,0.25%胰蛋白酶消化后1∶2传代。 2.3 细胞增殖测定
2.4 细胞甲胎蛋白和白蛋白mRNA表达测定
4.2 益气解毒中药含药血清对WB-F344细胞甲胎蛋白mRNA表达的影响
4.3 益气解毒中药含药血清对WB-F344细胞白蛋白mRNA表达的影响
5 讨论
成体干细胞的研发与利用已成为当今治疗领域的热门话题之一,微环境中的细胞外基质成分、细胞之间的接触、细胞因子等对成体干细胞的分化方向与进程起到重要的调控作用[4]。肝卵圆细胞是成体肝组织中主要的多能干细胞, 目前已被公认为肝脏的干细胞[5]。当肝脏严重受损时,正常情况下处于休眠状态的肝卵圆细胞将被激活,通过某些特异性的细胞因子诱导和调控作用,定向分化为肝细胞,这也是肝损伤后实现肝再生和肝组织自体修复的重要途径[6-8]。因此,了解肝卵圆细胞的增殖、定向分化机制,对阐明肝损伤的发病机制及应用肝干细胞移植治疗急慢性肝脏疾病具有十分重要的意义。
本课题组前期已进行了相关研究,发现疏肝健脾法能够通过上调肝干细胞相关细胞因子受体的表达量,促进肝干细胞的增殖分化[9]。为了进一步从分子生物学水平阐释益气解毒法治疗慢性肝病的作用原理,我们以肝干细胞为切入点,选用不同浓度的西洋参、牛黄成分剂和水煎剂的含药血清作用于大鼠肝卵圆细胞系WB-F344细胞,探讨益气解毒中药含药血清诱导肝干细胞增殖分化的内在机制。结果显示,浓度为10%、20%牛黄参含药血清均能促进WB-F344细胞增殖,且10%为药物血清增殖的最佳浓度,可以使WB-F344肝干细胞表面标志物AFP的mRNA表达量在细胞分化过程中逐渐减少,而肝细胞表面标志物ALB的mRNA表达量则逐渐增加,且成分剂优于水煎剂。说明益气解毒中药可以促进肝干细胞的增殖,诱导肝干细胞向肝细胞的分化,且成分剂牛黄参胶囊疗效优于西洋参、牛黄的水煎剂,为益气解毒促进肝再生和肝损伤的修复提供依据,也为临床运用不同剂型的中药复方诱导分化肝干细胞提供了实验和应用基础。
参考文献:
[1] Chamuleau RA, Deurholt T, Hoekstra R. Which are the right cells to be used in a bioartificial liver?[J]. Metab Brain Dis,2005,
20(4):327-350.
[2] Zdziarski P. Cellular transplantation-orthotopic liver transplantation alternative[J]. Pol Merkur Lekarski,2007, 23(136):297-301.
[3] Coleman WB, McCullough KD, Esch GL, et al. Evaluation of the differentiation potential of WB-F344 rat liver epithelial stem-like cells in vivo. Differentiation to hepatocytes after transplantation into dipeptidyⅠpeptidase-Ⅳ-deficient rat liver[J]. Am J Pathol,1997,151:353-359.
[4] 李晓利,王强,赵士富,崔春萍,等.抑瘤素表达产物诱导大鼠肝干细胞WB-F344体外分化[J].中国组织工程研究与临床康复,2007,11(46):9226.
[5] Vessey CJ, de la Hall PM. Hepatic stem cells:a review[J]. Pathology,2001,33:130-141.
[6] Knight B, Matthews VB, A khurst B, et al. Liver inflammation and cytokine production, but not acute phase protein synthesis, accompany the adult liver progenitor (oval) cell response to chronic liver injury[J]. Immunol Cell Biol,2005,83(4):364-374.
[7] Dalgetty DM, Medine CN, Iredale JP, et al. Progress and future challenges in stem cell-derived liver technologies[J]. Am J Physio1 Gastrointest Liver Physio1,2009,297(2):G241-248.
[8] Fiegel HC, Lange C, Kneser U, et al. Fetal and adult liver stem cells for liver regeneration and tissue engineering[J]. J Cell Mol Med,2006,10(3):577-587.
[9] 徐卫东.疏肝健脾法对肝干细胞诱导分化及调控机理的研究[D].湖北中医学院,2008.
(收稿日期:2012-02-12,编辑:华强)
关键词;益气解毒法;含药血清;肝卵圆细胞;WB-F344细胞;大鼠
中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1005-5304(2012)07-0031-03
目前,治疗肝衰竭最有效的方法是肝移植,然而供肝来源缺乏,仅有少数患者可以得到肝移植的机会。肝干细胞是体内存在的一种具有自我增殖能力和多向分化潜能的干细胞,可以分化为肝细胞和胆管上皮细胞等多种细胞。近年来,人们发现肝干细胞可参与肝脏的修复与重建,是肝细胞移植、生物人工肝的重要细胞来源,对急慢性肝病有明确的治疗作用,使肝干细胞的研究成为热点[1-2]。
WB-F344细胞是从成年雄性大鼠肝脏中分离得到的成体干细胞株,是大鼠肝卵圆细胞系,具有生物学特性稳定、易于体外培养等优点[3]。我们以细胞体外培养模型,观察具有益气养阴、清热解毒之功的牛黄参(牛黄、西洋参)含药血清对大鼠肝卵圆细胞系WB-F344增殖的影响及分化刺激的作用,探讨益气解毒中药调控肝干细胞的机理,为进一步揭示益气解毒法诱导肝干细胞的分化及其机制提供依据。
1 实验材料
1.1 动物与细胞
48只SPF级雄性Wistar大鼠,体质量180~200 g,湖北省实验动物研究中心提供,许可证号SCXK(鄂)2008-0005。WB-F344细胞购自上海复祥生物科技有限公司。
1.2 药物与试剂
体外培育牛黄、西洋参、牛黄参胶囊均由武汉健民大鹏药业有限公司提供。无菌磷酸盐缓冲液(武汉博士德生物工程有限公司);DMEM高糖液体培养基(HYCLONE,批号NWH0459);10%灭活的特优级胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司,批号110629);四甲基偶氮唑盐(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、胰蛋白酶均为美国GIBCO公司分装;Trizol(总RNA抽提试剂,碧云天生物技术研究所生产,批号120016);上、下游引物(BIONEER);Fermentas反转录试剂盒(美国MBI,货号00074555);肝细胞生长因子(HGF)、表皮细胞生长因子(EGF),美国派普泰克公司;青霉素、链霉素双抗(西化仪北京科技有限公司,批号20100925);地塞米松磷酸钠注射液(湖北天药药业股份有限公司,批号20100911);胰岛素(安徽宏业药业有限公司,批号20101101);氯仿(批号20110337)、无水乙醇(批号20110644)、异丙醇(批号20110215)、苯酚(批号20100429)均购自国药集团化学试剂有限公司。
1.3 仪器
CA-1800超净工作台(上海净化设备有限公司),BS60三用恒温水浴箱(北京医疗设备厂),RT-6500酶标仪(深圳雷杜生命科学股份有限公司),MCO-175二氧化碳培养箱(日本三洋公司),BG-QSPIN手掌型离心机(北京百晶生物技术有限公司),YX-280A不锈钢手提式消毒器(上海博迅实业有限公司),CK2-TR倒置显微镜(日本奥林巴斯),FORMA-725超低温冰箱(FORMA SCIENTIFIC公司),AJY-6000-U纯水器(重庆颐洋企业有限公司),ZEISS过滤器(德国蔡司),BP211D精密电子天平(德国赛多利斯),SUV2120紫外/可见分光光度计(韩国MECASYS公司),DYCZ-20A电泳槽(北京六一仪器厂),DYY-12电泳仪(北京六一仪器厂),GL-21B高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂),紫外透射反射分析仪(上海顾村电光仪器厂),凝胶图像分析仪(武汉千屏影像技术有限公司),PCR测定仪(美国BIO-RAD公司)。
2 实验方法
2.1 含药血清的制备
体外培育牛黄、西洋参配伍组(1∶6)采用传统水煎法灌胃动物制备含药血清(简称水煎组);依据现代药理药效研究,提取西洋参、牛黄中的有效成分制成牛黄参胶囊,然后胶囊取粉稀释使用,灌胃动物制作含药血清(简称成分组)。将大鼠分为空白组、水煎组、成分组,每组各16只。给药组以相应的药物连续灌胃,1次/d,含牛黄原药材浓度3.6 g/L,含西洋参原药材浓度21.6 g/L,大鼠按体质量100 g灌胃1 mL的量给药;空白组灌胃等量的生理盐水。连续1周,末次给药后2 h进行大鼠颈动脉取血,将采集的血液在室温中静置4 h,3 000 r/min离心15 min,将收集的血清在56 ℃水浴30 min进行灭活,而后过滤除菌,分装成小瓶,于-20 ℃保存备用,需要时用培养液配制成不同浓度含药血清。
2.2 细胞培养
用50 mL培养瓶,将WB-F344细胞接种于含10%胎牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺、100 U/mL青霉素及链霉素的高糖DMEM培养基中,细胞浓度为2×104个/mL,置于5%CO2、37 ℃培养箱中培养。细胞换液时间为2~3 d,3~5 d传代,0.25%胰蛋白酶消化后1∶2传代。 2.3 细胞增殖测定
2.4 细胞甲胎蛋白和白蛋白mRNA表达测定
4.2 益气解毒中药含药血清对WB-F344细胞甲胎蛋白mRNA表达的影响
4.3 益气解毒中药含药血清对WB-F344细胞白蛋白mRNA表达的影响
5 讨论
成体干细胞的研发与利用已成为当今治疗领域的热门话题之一,微环境中的细胞外基质成分、细胞之间的接触、细胞因子等对成体干细胞的分化方向与进程起到重要的调控作用[4]。肝卵圆细胞是成体肝组织中主要的多能干细胞, 目前已被公认为肝脏的干细胞[5]。当肝脏严重受损时,正常情况下处于休眠状态的肝卵圆细胞将被激活,通过某些特异性的细胞因子诱导和调控作用,定向分化为肝细胞,这也是肝损伤后实现肝再生和肝组织自体修复的重要途径[6-8]。因此,了解肝卵圆细胞的增殖、定向分化机制,对阐明肝损伤的发病机制及应用肝干细胞移植治疗急慢性肝脏疾病具有十分重要的意义。
本课题组前期已进行了相关研究,发现疏肝健脾法能够通过上调肝干细胞相关细胞因子受体的表达量,促进肝干细胞的增殖分化[9]。为了进一步从分子生物学水平阐释益气解毒法治疗慢性肝病的作用原理,我们以肝干细胞为切入点,选用不同浓度的西洋参、牛黄成分剂和水煎剂的含药血清作用于大鼠肝卵圆细胞系WB-F344细胞,探讨益气解毒中药含药血清诱导肝干细胞增殖分化的内在机制。结果显示,浓度为10%、20%牛黄参含药血清均能促进WB-F344细胞增殖,且10%为药物血清增殖的最佳浓度,可以使WB-F344肝干细胞表面标志物AFP的mRNA表达量在细胞分化过程中逐渐减少,而肝细胞表面标志物ALB的mRNA表达量则逐渐增加,且成分剂优于水煎剂。说明益气解毒中药可以促进肝干细胞的增殖,诱导肝干细胞向肝细胞的分化,且成分剂牛黄参胶囊疗效优于西洋参、牛黄的水煎剂,为益气解毒促进肝再生和肝损伤的修复提供依据,也为临床运用不同剂型的中药复方诱导分化肝干细胞提供了实验和应用基础。
参考文献:
[1] Chamuleau RA, Deurholt T, Hoekstra R. Which are the right cells to be used in a bioartificial liver?[J]. Metab Brain Dis,2005,
20(4):327-350.
[2] Zdziarski P. Cellular transplantation-orthotopic liver transplantation alternative[J]. Pol Merkur Lekarski,2007, 23(136):297-301.
[3] Coleman WB, McCullough KD, Esch GL, et al. Evaluation of the differentiation potential of WB-F344 rat liver epithelial stem-like cells in vivo. Differentiation to hepatocytes after transplantation into dipeptidyⅠpeptidase-Ⅳ-deficient rat liver[J]. Am J Pathol,1997,151:353-359.
[4] 李晓利,王强,赵士富,崔春萍,等.抑瘤素表达产物诱导大鼠肝干细胞WB-F344体外分化[J].中国组织工程研究与临床康复,2007,11(46):9226.
[5] Vessey CJ, de la Hall PM. Hepatic stem cells:a review[J]. Pathology,2001,33:130-141.
[6] Knight B, Matthews VB, A khurst B, et al. Liver inflammation and cytokine production, but not acute phase protein synthesis, accompany the adult liver progenitor (oval) cell response to chronic liver injury[J]. Immunol Cell Biol,2005,83(4):364-374.
[7] Dalgetty DM, Medine CN, Iredale JP, et al. Progress and future challenges in stem cell-derived liver technologies[J]. Am J Physio1 Gastrointest Liver Physio1,2009,297(2):G241-248.
[8] Fiegel HC, Lange C, Kneser U, et al. Fetal and adult liver stem cells for liver regeneration and tissue engineering[J]. J Cell Mol Med,2006,10(3):577-587.
[9] 徐卫东.疏肝健脾法对肝干细胞诱导分化及调控机理的研究[D].湖北中医学院,2008.
(收稿日期:2012-02-12,编辑:华强)