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摘要：目的 优选酸枣仁-五味子药对的最佳提取工艺。方法 采用正交试验法，以酸枣仁-五味子药对中五味子醇甲含量和水提浸膏得率为指标，采用超高液相色谱法测定五味子醇甲含量，考察加水量、提取时间、提取次数对水提取工艺的影响。结果 最佳提取工艺为加10倍药材量的水，煎煮3次，每次1.5 h。结论 优选的提取工艺稳定、可行。
关键词：酸枣仁-五味子药对；正交试验；提取工艺；五味子醇甲
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2012.03.024
中图分类号：R283.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）03-0062-03
酸枣仁具有镇静作用，主要用于虚烦不眠、惊悸多梦、体虚多汗、津伤口渴等症[1]。五味子具有收敛固涩、益气生津、补肾宁心之效[2]。酸枣仁与五味子合用可滋阴养血、安神镇惊、消除疲劳、增加耐力等[3]。酸枣仁镇静催眠作用的主要活性成分以其皂苷类成分药理活性较强，五味子中主要有效成分为木脂素类成分，其中以五味子醇甲含量为最高。因传统提取方法为水煎煮提取，皂苷类成分很难被充分提出，且不稳定。为保证制剂的疗效，本研究以五味子醇甲含量和浸膏得率为指标，采用正交试验优选出酸枣仁-五味子药对的最佳提取工艺。
1 仪器与试药
Waters Acquity H-Class UPLC超高效液相色谱仪（美国Waters公司），Acquity UPLC BEHC18色谱柱（2.1 mm×50 mm， 1.7 ?m），Acquity PDA检测器以及Waters Empower2软件， KQ3200DB型数控超声波清洗器（江苏昆山超声仪器有限公司），0.22 ?m微孔滤膜（上海陆纳生物科技有限公司），BP211D十万分之一天平（德国塞多利斯公司），HH-S型水浴锅（巩义市英峪予华仪器厂），TF-18通风橱；D2F-6020真空干燥箱，KMD型调温电热套。
基金项目：安徽省教育厅科研项目（KJ2008A41ZC）
酸枣仁与五味子药材均购于合肥深南中药饮片有限公司，经安徽中医学院第一附属医院孟楣主任药师鉴定为合格药材；五味子醇甲对照品（中国药品生物制品检定所，批号110857- 200507）。乙腈、甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 提取工艺设计
在确定水提溶媒的基础上，选择加水量、煎煮时间、煎煮次数3个因素进行考察。称取1∶1配比的酸枣仁、五味子药材共9份，用L9（34）正交表安排试验，分别进行提取、测定，并对试验结果进行直观分析与方差分析。因素水平见表1。
2.2 正交试验样品溶液的制备
取酸枣仁、五味子各100 g，置2 000 mL圆底烧瓶中，按表1设计选择不同加水量、煎煮时间、煎煮次数进行提取，提取液浓缩定容至100 mL，共得到1～9号浓缩液，标注为样品液1～9号。
2.3 浸膏得率测定
分别精密吸取1～9号浓缩液20 mL，置干燥已恒重的蒸发皿中，水浴蒸干后，105 ℃干燥3 h，移置干燥器中，冷却30 min，迅速精密称定重量，根据两次重量之差，计算提取液中固体含量[4]。结果浸膏得率分别为15.54%、22.99%、24.86%、24.17%、26.88%、19.87%、27.67%、20.82%、24.78%。
2.4 五味子醇甲含量测定
2.4.1 色谱条件 色谱柱：Acquity UPLC BEHC18色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7 ?m）；流动相：乙腈-水（55∶45）；流速：0.25 mL/min；检测波长：254 nm；柱温：30 ℃；进样量：2 ?L。五味子醇甲色谱峰与相邻色谱峰的分离度不低于1.5。
2.4.2 对照品溶液的制备 精密称取五味子醇甲对照品，加甲醇制成浓度为0.103 6 mg/mL的对照品溶液。超高效液相色谱图见图1。
2.4.3 供试品溶液的制备 取正交试验的9份样品液各10 mL，置蒸发皿中，水浴蒸干后，用甲醇溶解，经0.22 ?m微孔滤膜滤过定容至10 mL容量瓶中，即得。2号样品的超高液相色谱图见图1。
2.4.4 线性关系的考察 五味子醇甲对照品溶液分别进样0.5、1、2、3、4、5 ?L，测定峰面积。以五味子醇甲的进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。得回归方程为Y=842 975X-45 439，r=1.0。结果表明，在0.051 8～0.518 ?g内，线性关系良好。
2.4.5 精密度试验 吸取对照品溶液，连续进样6次，测峰面积，计算RSD=0.41%。
2.4.6 稳定性试验 取标准品溶液，分别在0、2、4、8、16、24 h按“2.4.1”项下色谱条件测定，测定样品中五味子醇甲的峰面积，计算RSD=0.95%。
2.4.7 重复性试验 取2号样品6份，每份5 mL，按“2.4.3”项下方法处理，“2.4.1”项下色谱条件，每份进样4 ?L，测定样品中五味子醇甲的峰面积，计算RSD=0.37%。
2.4.8 加样回收率试验 取已知五味子醇甲含量0.052 8 mg/mL的2号样品6份，每份精密量取5.0 mL，加入五味子醇甲的對照品溶液2.5 mL，按“2.4.3”项下方法制备供试品溶液，测定五味子醇甲的含量，计算回收率。结果见表2。
2.4.9 样品含量测定 取正交试验的9份样品液各10 mL，按 “2.4.3”项下方法分别处理，测定并计算，结果9份样品中五味子醇甲含量分别为0.047 9、0.052 8、0.064 1、0.039 3、0.0922、0.066 3、0.0718、0.103 8、0.067 5 mg/mL。 2.4.10 结果分析 试验结果见表3，方差分析见表4、表5。
通过直观分析及方差分析可知，煎煮时间对五味子醇甲有显著影响，煎煮次数对浸膏得率有显著影响，五味子醇甲的最佳提取条件为A3B2C3，浸膏得率的最佳提取条件为A3B2C3，综合分析得出最佳提取条件为A3B2C3。即加水量为10倍，煎煮次数3次，煎煮时间为1.5 h。
2.5 最佳工艺条件的验证
取酸枣仁、五味子各10.0 g，加入10倍量的水，每次煎煮1.5 h，煎煮3次，进行3次平行试验，五味子醇甲平均含量为0.108 9 mg/mL。结果表明，验证试验结果比正交试验结果更好，所确定的提取工艺稳定，合理可行，可操作性强，可以作为酸枣仁-五味子药对的最佳提取工艺。
3 讨论
Acquity UPLC H-Class系统保留了传统高效液相色谱仪的操作方法，可实现更精确的积分和定量，同时将分析时间大大缩短，并减少实验室多达95%的溶剂消耗量。本试验将超高液相色谱用于五味子醇甲含量测定研究，与普通HPLC采用C18填料的色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m）比较，其分析速度提高了4倍以上，且具有较高的分析通量，同时也具有良好的准确度、精密度和耐用性，方法可靠，重复性好。
通过对《中医方剂大辞典》[5]收载方剂进行检索，在同时含有酸枣仁-五味子药对的复方制剂中，二者的配伍比例以1∶1居多，因此，确定酸枣仁-五味子药对水提工艺的比例为1∶1。
参考预试结果，酸枣仁-五味子药对的水提工艺选择加水量、煎煮时间、煎煮次数为影响因素，以五味子醇甲的含量及浸膏得率为考察指标，采用正交试验设计，以多指标综合平衡法对酸枣仁与五味子药对的提取工艺进行考察，优选出了最佳工艺条件，酸枣仁-五味子药对的最佳水提取工艺为A3B2C3，即加水量为10倍，煎煮次数3次，煎煮时间为1.5 h。
参考文献：
[1] 高家荣，魏良兵，韩燕全，等.复方枣仁安神胶囊质量控制研究[J].中国中医药信息杂志，2010，17（7）：57-59.
[2] 霍艳双，陈晓辉，李康，等.北五味子的镇静、催眠作用[J].沈阳药科大学学报，2005，22（2）：126.
[3] 李廷利，孙春宇，黄莉莉.天王补心丸对失眠大鼠睡眠时相的影响[J].中药药理与临床，2007，23（1）：5-7.
[4] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中國医药科技出版社，2010：附录62.
[5] 彭怀仁.中医方剂大辞典[M].北京：人民卫生出版社，1995.
（收稿日期：2011-07-22，编辑：陈静）
关键词：酸枣仁-五味子药对；正交试验；提取工艺；五味子醇甲
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2012.03.024
中图分类号：R283.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）03-0062-03
酸枣仁具有镇静作用，主要用于虚烦不眠、惊悸多梦、体虚多汗、津伤口渴等症[1]。五味子具有收敛固涩、益气生津、补肾宁心之效[2]。酸枣仁与五味子合用可滋阴养血、安神镇惊、消除疲劳、增加耐力等[3]。酸枣仁镇静催眠作用的主要活性成分以其皂苷类成分药理活性较强，五味子中主要有效成分为木脂素类成分，其中以五味子醇甲含量为最高。因传统提取方法为水煎煮提取，皂苷类成分很难被充分提出，且不稳定。为保证制剂的疗效，本研究以五味子醇甲含量和浸膏得率为指标，采用正交试验优选出酸枣仁-五味子药对的最佳提取工艺。
1 仪器与试药
Waters Acquity H-Class UPLC超高效液相色谱仪（美国Waters公司），Acquity UPLC BEHC18色谱柱（2.1 mm×50 mm， 1.7 ?m），Acquity PDA检测器以及Waters Empower2软件， KQ3200DB型数控超声波清洗器（江苏昆山超声仪器有限公司），0.22 ?m微孔滤膜（上海陆纳生物科技有限公司），BP211D十万分之一天平（德国塞多利斯公司），HH-S型水浴锅（巩义市英峪予华仪器厂），TF-18通风橱；D2F-6020真空干燥箱，KMD型调温电热套。
基金项目：安徽省教育厅科研项目（KJ2008A41ZC）
酸枣仁与五味子药材均购于合肥深南中药饮片有限公司，经安徽中医学院第一附属医院孟楣主任药师鉴定为合格药材；五味子醇甲对照品（中国药品生物制品检定所，批号110857- 200507）。乙腈、甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 提取工艺设计
在确定水提溶媒的基础上，选择加水量、煎煮时间、煎煮次数3个因素进行考察。称取1∶1配比的酸枣仁、五味子药材共9份，用L9（34）正交表安排试验，分别进行提取、测定，并对试验结果进行直观分析与方差分析。因素水平见表1。
2.2 正交试验样品溶液的制备
取酸枣仁、五味子各100 g，置2 000 mL圆底烧瓶中，按表1设计选择不同加水量、煎煮时间、煎煮次数进行提取，提取液浓缩定容至100 mL，共得到1～9号浓缩液，标注为样品液1～9号。
2.3 浸膏得率测定
分别精密吸取1～9号浓缩液20 mL，置干燥已恒重的蒸发皿中，水浴蒸干后，105 ℃干燥3 h，移置干燥器中，冷却30 min，迅速精密称定重量，根据两次重量之差，计算提取液中固体含量[4]。结果浸膏得率分别为15.54%、22.99%、24.86%、24.17%、26.88%、19.87%、27.67%、20.82%、24.78%。
2.4 五味子醇甲含量测定
2.4.1 色谱条件 色谱柱：Acquity UPLC BEHC18色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7 ?m）；流动相：乙腈-水（55∶45）；流速：0.25 mL/min；检测波长：254 nm；柱温：30 ℃；进样量：2 ?L。五味子醇甲色谱峰与相邻色谱峰的分离度不低于1.5。
2.4.2 对照品溶液的制备 精密称取五味子醇甲对照品，加甲醇制成浓度为0.103 6 mg/mL的对照品溶液。超高效液相色谱图见图1。
2.4.3 供试品溶液的制备 取正交试验的9份样品液各10 mL，置蒸发皿中，水浴蒸干后，用甲醇溶解，经0.22 ?m微孔滤膜滤过定容至10 mL容量瓶中，即得。2号样品的超高液相色谱图见图1。
2.4.4 线性关系的考察 五味子醇甲对照品溶液分别进样0.5、1、2、3、4、5 ?L，测定峰面积。以五味子醇甲的进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。得回归方程为Y=842 975X-45 439，r=1.0。结果表明，在0.051 8～0.518 ?g内，线性关系良好。
2.4.5 精密度试验 吸取对照品溶液，连续进样6次，测峰面积，计算RSD=0.41%。
2.4.6 稳定性试验 取标准品溶液，分别在0、2、4、8、16、24 h按“2.4.1”项下色谱条件测定，测定样品中五味子醇甲的峰面积，计算RSD=0.95%。
2.4.7 重复性试验 取2号样品6份，每份5 mL，按“2.4.3”项下方法处理，“2.4.1”项下色谱条件，每份进样4 ?L，测定样品中五味子醇甲的峰面积，计算RSD=0.37%。
2.4.8 加样回收率试验 取已知五味子醇甲含量0.052 8 mg/mL的2号样品6份，每份精密量取5.0 mL，加入五味子醇甲的對照品溶液2.5 mL，按“2.4.3”项下方法制备供试品溶液，测定五味子醇甲的含量，计算回收率。结果见表2。
2.4.9 样品含量测定 取正交试验的9份样品液各10 mL，按 “2.4.3”项下方法分别处理，测定并计算，结果9份样品中五味子醇甲含量分别为0.047 9、0.052 8、0.064 1、0.039 3、0.0922、0.066 3、0.0718、0.103 8、0.067 5 mg/mL。 2.4.10 结果分析 试验结果见表3，方差分析见表4、表5。
通过直观分析及方差分析可知，煎煮时间对五味子醇甲有显著影响，煎煮次数对浸膏得率有显著影响，五味子醇甲的最佳提取条件为A3B2C3，浸膏得率的最佳提取条件为A3B2C3，综合分析得出最佳提取条件为A3B2C3。即加水量为10倍，煎煮次数3次，煎煮时间为1.5 h。
2.5 最佳工艺条件的验证
取酸枣仁、五味子各10.0 g，加入10倍量的水，每次煎煮1.5 h，煎煮3次，进行3次平行试验，五味子醇甲平均含量为0.108 9 mg/mL。结果表明，验证试验结果比正交试验结果更好，所确定的提取工艺稳定，合理可行，可操作性强，可以作为酸枣仁-五味子药对的最佳提取工艺。
3 讨论
Acquity UPLC H-Class系统保留了传统高效液相色谱仪的操作方法，可实现更精确的积分和定量，同时将分析时间大大缩短，并减少实验室多达95%的溶剂消耗量。本试验将超高液相色谱用于五味子醇甲含量测定研究，与普通HPLC采用C18填料的色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m）比较，其分析速度提高了4倍以上，且具有较高的分析通量，同时也具有良好的准确度、精密度和耐用性，方法可靠，重复性好。
通过对《中医方剂大辞典》[5]收载方剂进行检索，在同时含有酸枣仁-五味子药对的复方制剂中，二者的配伍比例以1∶1居多，因此，确定酸枣仁-五味子药对水提工艺的比例为1∶1。
参考预试结果，酸枣仁-五味子药对的水提工艺选择加水量、煎煮时间、煎煮次数为影响因素，以五味子醇甲的含量及浸膏得率为考察指标，采用正交试验设计，以多指标综合平衡法对酸枣仁与五味子药对的提取工艺进行考察，优选出了最佳工艺条件，酸枣仁-五味子药对的最佳水提取工艺为A3B2C3，即加水量为10倍，煎煮次数3次，煎煮时间为1.5 h。
参考文献：
[1] 高家荣，魏良兵，韩燕全，等.复方枣仁安神胶囊质量控制研究[J].中国中医药信息杂志，2010，17（7）：57-59.
[2] 霍艳双，陈晓辉，李康，等.北五味子的镇静、催眠作用[J].沈阳药科大学学报，2005，22（2）：126.
[3] 李廷利，孙春宇，黄莉莉.天王补心丸对失眠大鼠睡眠时相的影响[J].中药药理与临床，2007，23（1）：5-7.
[4] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中國医药科技出版社，2010：附录62.
[5] 彭怀仁.中医方剂大辞典[M].北京：人民卫生出版社，1995.
（收稿日期：2011-07-22，编辑：陈静）