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摘要[目的]研究杀虫剂对松墨天牛延伸因子2（MaEF2）的影响，为深入研究MaEF2的功能、利用延伸因子基因靶标有效防治松墨天牛提供参考。[方法]从松墨天牛文库中分离得到EF2cDNA序列，利用RTqPCR技术测定了11种杀虫剂胁迫后MaEF2的相对表达量。[结果]得到的MaEF2基因的部分序列，长度为1 184 bp，编码287个氨基酸；与黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）和家蚕（Bombyx mori）氨基酸相似性分别为92% 和93%。RTqPCR测定结果表明，杀虫剂作用下MaEF2均上调表达，表达量为对照的1.28～11.59倍。[结论]啶虫脒的相对表达量最高，毒死蜱和噻虫啉的表达量最低，这可能表明松墨天牛产生了自我保护反应。
关键词松墨天牛；杀虫剂；延伸因子2；RTqPCR
中图分类号S763.38文献标识码A文章编号0517-6611（2014）24-08112-04
The Expression of the Elongation Factor 2 Gene from Monochamus alternatus in Response to 11 Kinds of Insecticide
LUO Linlin， LIN Tong（College of Forestry， South China Agricultural University， Guangzhou， Guangdong 510225）
Abstract [Objective] This study provides molecular data for the influence of insecticides on M. alternatus EF2， and the reference for the further research on the functions of M. alternatus EF2 which can be a target against M. alternatus. [Method] A partial cDNA sequence of elongation factor 2 gene from M. alternatus library was isolated and named MaEF2， and the relative expression of MaEF2 in response to 11 kinds of insecticides was determined by RTqPCR. [Result] The results showed that MaEF2 is 1184bp in length which has 92% and 93% amino acid similarity with the EF2 of Drosophila melanogaster and Bombyx mori， respectively.MaEF2 were up regulated under pesticides stress， and the expression level was changed from 1.28 times to 11.59 times as that as the control. [Conclusion] The expression of acetamiprid was the highest， the expression of thiacloprid and chlorpyrifos was the lowest， all of which showed that M. alternatus produced a selfprotective reaction to the insecticides.
Key words Monochamus alternatus Hope； Pesticides； EF2； Real time quantitative PCR
延伸因子（elongation factor，EF）是參与蛋白合成过程中肽链延伸的蛋白因子，在所有多细胞生物体的新陈代谢过程中发挥着非常重要的作用，它包括延伸因子 EF1 和延伸因子 EF2[1-3]。延伸因子 EF1 由 α、β、γ 和 δ 4个亚基组成，是细胞内普遍存在且大量表达的多聚核糖体蛋白质，在基因表达和翻译过程中起重要作用[4]。EF2 是真核生物蛋白质合成时肽链延伸过程中必不可少的蛋白因子[5]，它能催化GTP 水解，使肽酰-tRNA 从核糖体的氨酰基位点（aminoacyl site，A-site）移到肽基位点（peptidyl site，Psite），从而使核糖体沿着 mRNA 运动以完成转录过程[6]。因此，EF2 的正常表达关系到机体细胞的生长及蛋白质的合成。EF2 通过不断改变其在细胞内的表达量，以调节总蛋白质的合成[7]，同时，在不同机制作用下，EF2 的活性和表达量也会发生改变[8]。研究表明在甲壳动物养殖生产中，水体环境中的应激因素（pH、重金属等）可以引起广泛的细胞损伤，包括 DNA 损害、脂质过氧化作用以及蛋白质氧化等[9]，最终导致 EF2 的表达量发生变化。
松墨天牛（Monochamus alternatus）是为害马尾松（Pinus massoniana）等林木的重大森林害虫，成虫又是松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）的主要传播媒介，因其为害严重且防治困难已被世界上许多国家列入检疫对象[10]。
笔者首次克隆了松墨天牛延伸因子 EF2 基因并分析该基因在11种杀虫剂作用后的相对表达含量，旨在了解松墨天牛延伸因子 EF2基因的结构以及该基因在不同类型杀虫剂作用下的反应，为今后进一步研究松墨天牛 EF2 的功能和与杀虫剂之间的作用机制提供理论依据。 1材料与方法
1.1供试昆虫松墨天牛幼虫采自从化马尾松次生林，室内配置人工饲料，在人工气候箱中培养，设置环境条件为：25 ℃，相对湿度70%～75%，黑暗条件，饲养至蜕变为成虫[11]。
1.2主要试剂Trizol总RNA抽提试剂盒购自OMEGA生物有限公司；PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser、SYBR Premix Ex TaqTM购自大连宝生物工程有限公司；DNA分子量标准1kp DNA Ladder购自天根生化科技有限公司。
1.3基因克隆和序列比对构建了松墨天牛cDNA文库，从中分离得到松墨天牛EF2基因。用GenBank的BLASTN和BLASTP在线工具进行松墨天牛EF2及其他昆虫EF2核酸序列的相似性分析；用DNAMAN软件进行多序列比对分析。
1.4杀虫剂处理用6种化学杀虫剂和5种微生物杀虫剂处理松墨天牛成虫，杀虫剂信息见表1。每种处理3个重复，每个重复3头试虫，受药12 h后用液氮速冻，于-80 ℃保存备用。
1.5总RNA提取与cDNA合成用Trizol总RNA抽提试剂盒提取杀虫剂处理后松墨天牛总RNA，纯化后，经琼脂糖凝胶电泳检测，并用微量紫外分光光度仪 （Nanodrop 2000） 检测其浓度，置于-80 ℃保存备用。参照反转录试剂盒PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser说明书，获得第一链cDNA，作为RTqPCR的反应模板，置于-20 ℃保存备用。
1.6RTqPCR检测以EF2在成虫（未经药剂处理）中的表达量为标准参量，以微管蛋白（βactin）基因为内参基因，无菌超纯水为阴性对照，采用RTqPCR（SYBR Green）检测MaEF2在杀虫剂胁迫后的相对表达量。RTqPCR 反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，进行40个循环。荧光定量PCR仪为罗氏LC480，设cDNA样品3次重复，反应结束后采集目标基因和内参基因的 Ct值，利用 2-ΔΔCT相对定量法计算相对表达量[12]。
安徽农业科学2014年1.7数据分析采用DPS软件中的Duncan方法对RTPCR数据进行显著性方差分析。
表1农药规格及稀释浓度
药剂名称生产厂家稀释倍数处理方法5%啶虫脒乳油佛山市大兴生物化工公司900倍液喷雾18%杀虫双水剂中山凯中公司700倍液喷雾2.5%敌杀死拜耳作物科学公司4 000倍液喷雾24%灭多威可溶性液剂江门市大光明农化新会公司240倍液喷雾48%毒死蜱乳油江苏苏州佳辉化工公司1 600倍液喷雾5% 氯氰菊酯乳油邹平县绿大药业公司1 500倍液喷雾40%噻虫啉悬浮剂利民化工股份公司2 000倍液喷雾0.3%印楝素乳油海南利特蒙生物农药公司800倍液喷雾100亿活芽孢/ml BT悬浮剂太原高新技术产业西芮生物公司200倍液口腔注射200亿活孢子/g绿僵菌粉剂厦门多多生物公司1×108个/ul浸泡10 s400亿个孢子/g白僵菌粉剂江西天人生态公司1×108个/ul浸泡10 s对照-清水喷雾
2结果与分析
2.1MaEF2 序列从松墨天牛基因文库中获得EF2 基因的 cDNA，长度为1 184 bp，编码287个氨基酸，命名为MaEF2，核苷酸序3小结与讨论
真核生物的延伸因子2是一种质量为100 000 Da的单体多肽，通过催化依赖于GTP水解的转位反应将A位生成的肽基-tRNA转移到P位，原来P位上空载的tRNA被逐出核糖体，同时，核糖体沿着mRNA向前移动一个密码子[6，13]。目前，已分离获得果蝇、老鼠和仓鼠、甲烷球菌以及小球藻等真核生物的EF2基因[14]，松墨天牛EF2的克隆是首次报道。
EF2 蛋白的主要结构在进化过程中非常保守，經GenBank数据库BLASTN、BLASTX比对表明，推导的 MaEF2 氨基酸序列与其他已知昆虫 EF2 氨基酸序列有 84%～94%的同源性。笔者克隆出的MaEF2基因长度为1 184 bp，编码287个氨基酸，但根据其他昆虫EF2基因全长序列分析，获得的MaEF2可能只是EF2基因全长的部分序列，还缺少3’端约1 kbp的氨基酸序列，但这不影响分析该基因的表达。后期，将进行MaEF2全长基因的克隆，以深入了解松墨天牛EF2的结构和功能。
该研究检测了经杀虫剂胁迫后，EF2 mRNA在松墨天牛成虫中的表达情况，结果显示该基因在啶虫脒作用后的相对表达量最高，为空白对照表达量的11.59倍，其次是杀虫双，为8.02倍，绿僵菌和白僵菌的胁迫作用无显著差异，毒死蜱和灭多威的作用效果较弱。不同杀虫剂作用于MaEF2基因，导致其均有不同程度的上调表达，这可能是松墨天牛产生的自我保护反应。生物有机体细胞适应环境压力的能力是它们生存的关键，生物体在进化过程中使其对环境和生理压力具有一定的应答能力[1]，然而许多应答的共同特点是选择性调节基因的转录和翻译，包括允许可逆基因的快速表达[15-16]。目前研究表明环境压力可诱导 EF2 基因的表达，从而调节蛋白质合成以应对环境条件的变化[17-18]。WANG等[1]研究了凡纳滨对虾EF2 基因在肝胰腺中的相对表达量，结果显示，EF2 基因在酸性条件处理下随着时间的延长呈现先增加后降低再增加的表达趋势；在碱性条件处理下，结果同样是呈现先增加后降低再增加的表达趋势。在环境条件变化下，包括在杀虫剂作用下松墨天牛 EF2 基因的具体功能和作用机制还需进一步研究。
参考文献
[1] WANG L，LIU Y，WANG W N，et al.Molecular characterization and expression analysis of elongation factors 1A and 2 from the Pacific white shrimp，Litopenaeus vannamei[J].Molecular Biology Reports，2011，38（3）：2167-2178. [2] NILSSON J，NISSEN P.Elongation factors on the ribosome[J].Current Opinion in Structural Biology，2005，15（3）：349-354.
[3] PROUD C G.Peptide-chain elongation in eukaryotes[J].Molecular Biology Reports，1994，19（3）：161-170.
[4] ANDERSEN G R，NISSEN P，NYBORG J.Elongation factors in protein biosynthesis[J].Trends in Biochemical Sciences，2003，28（8）：434-441.
[5] WEISSBACH H，OCHOA S.Soluble factors required for eukaryotic protein synthesis[J].Annual Review of Biochemistry，1976，45（1）：191-216.
[6] KOHNO K，UCHIDA T，OHKUBO H，et al.Amino acid sequence of mammalian elongation factor 2 deduced from the cDNA sequence：Homology with GTP-binding proteins[J].Biochemistry，1986，83（14）：4978-4982.
[7] EUN J L，KIM C W.Functional characterization of the promoter region of the chicken elongation factor-2 gene[J].Gene，2007，386（1）：183-190.
[8] MALAVE T M，FORNEY J D.Identification of a developmentally regulated translation elongation factor 2 in Tetrahymena thermophila[J].Gene，2004，326（1）：97-105.
[9] FIGUEIREDOPEREIRA M E，YAKUSHIN S，COHEN G.Accumulation of ubiquitinated proteins in mouse neuronal cells induced by oxidative stress[J].Molecular Biology Reports，1997，24（1）：35-38.
[10] 羅淋淋，韦春梅，林同.松墨天牛分子生物学研究进展[J].中国森林病虫，2014，33（1）：24-28.
[11] 徐金华，黄秀凤，徐华潮，等.松墨天牛室内人工饲养及其生物学特性观察[J].浙江林业科技，2009，29（4）：86-88.
[12] LIVAK K J，SCHMITTGEN T D.Analysis of relative gene expression data using realtime quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method[J].Methods，2001，25（4）：402-408.
[13] GRINBLAT Y，BROWN N H，KAFATOS F C.Isolation and characterization of the DrosoPhila translation elongation factor 2 gene[J].Nucleic Acids Research，1989，17（18）：7301-7314.
关键词松墨天牛；杀虫剂；延伸因子2；RTqPCR
中图分类号S763.38文献标识码A文章编号0517-6611（2014）24-08112-04
The Expression of the Elongation Factor 2 Gene from Monochamus alternatus in Response to 11 Kinds of Insecticide
LUO Linlin， LIN Tong（College of Forestry， South China Agricultural University， Guangzhou， Guangdong 510225）
Abstract [Objective] This study provides molecular data for the influence of insecticides on M. alternatus EF2， and the reference for the further research on the functions of M. alternatus EF2 which can be a target against M. alternatus. [Method] A partial cDNA sequence of elongation factor 2 gene from M. alternatus library was isolated and named MaEF2， and the relative expression of MaEF2 in response to 11 kinds of insecticides was determined by RTqPCR. [Result] The results showed that MaEF2 is 1184bp in length which has 92% and 93% amino acid similarity with the EF2 of Drosophila melanogaster and Bombyx mori， respectively.MaEF2 were up regulated under pesticides stress， and the expression level was changed from 1.28 times to 11.59 times as that as the control. [Conclusion] The expression of acetamiprid was the highest， the expression of thiacloprid and chlorpyrifos was the lowest， all of which showed that M. alternatus produced a selfprotective reaction to the insecticides.
Key words Monochamus alternatus Hope； Pesticides； EF2； Real time quantitative PCR
延伸因子（elongation factor，EF）是參与蛋白合成过程中肽链延伸的蛋白因子，在所有多细胞生物体的新陈代谢过程中发挥着非常重要的作用，它包括延伸因子 EF1 和延伸因子 EF2[1-3]。延伸因子 EF1 由 α、β、γ 和 δ 4个亚基组成，是细胞内普遍存在且大量表达的多聚核糖体蛋白质，在基因表达和翻译过程中起重要作用[4]。EF2 是真核生物蛋白质合成时肽链延伸过程中必不可少的蛋白因子[5]，它能催化GTP 水解，使肽酰-tRNA 从核糖体的氨酰基位点（aminoacyl site，A-site）移到肽基位点（peptidyl site，Psite），从而使核糖体沿着 mRNA 运动以完成转录过程[6]。因此，EF2 的正常表达关系到机体细胞的生长及蛋白质的合成。EF2 通过不断改变其在细胞内的表达量，以调节总蛋白质的合成[7]，同时，在不同机制作用下，EF2 的活性和表达量也会发生改变[8]。研究表明在甲壳动物养殖生产中，水体环境中的应激因素（pH、重金属等）可以引起广泛的细胞损伤，包括 DNA 损害、脂质过氧化作用以及蛋白质氧化等[9]，最终导致 EF2 的表达量发生变化。
松墨天牛（Monochamus alternatus）是为害马尾松（Pinus massoniana）等林木的重大森林害虫，成虫又是松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）的主要传播媒介，因其为害严重且防治困难已被世界上许多国家列入检疫对象[10]。
笔者首次克隆了松墨天牛延伸因子 EF2 基因并分析该基因在11种杀虫剂作用后的相对表达含量，旨在了解松墨天牛延伸因子 EF2基因的结构以及该基因在不同类型杀虫剂作用下的反应，为今后进一步研究松墨天牛 EF2 的功能和与杀虫剂之间的作用机制提供理论依据。 1材料与方法
1.1供试昆虫松墨天牛幼虫采自从化马尾松次生林，室内配置人工饲料，在人工气候箱中培养，设置环境条件为：25 ℃，相对湿度70%～75%，黑暗条件，饲养至蜕变为成虫[11]。
1.2主要试剂Trizol总RNA抽提试剂盒购自OMEGA生物有限公司；PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser、SYBR Premix Ex TaqTM购自大连宝生物工程有限公司；DNA分子量标准1kp DNA Ladder购自天根生化科技有限公司。
1.3基因克隆和序列比对构建了松墨天牛cDNA文库，从中分离得到松墨天牛EF2基因。用GenBank的BLASTN和BLASTP在线工具进行松墨天牛EF2及其他昆虫EF2核酸序列的相似性分析；用DNAMAN软件进行多序列比对分析。
1.4杀虫剂处理用6种化学杀虫剂和5种微生物杀虫剂处理松墨天牛成虫，杀虫剂信息见表1。每种处理3个重复，每个重复3头试虫，受药12 h后用液氮速冻，于-80 ℃保存备用。
1.5总RNA提取与cDNA合成用Trizol总RNA抽提试剂盒提取杀虫剂处理后松墨天牛总RNA，纯化后，经琼脂糖凝胶电泳检测，并用微量紫外分光光度仪 （Nanodrop 2000） 检测其浓度，置于-80 ℃保存备用。参照反转录试剂盒PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser说明书，获得第一链cDNA，作为RTqPCR的反应模板，置于-20 ℃保存备用。
1.6RTqPCR检测以EF2在成虫（未经药剂处理）中的表达量为标准参量，以微管蛋白（βactin）基因为内参基因，无菌超纯水为阴性对照，采用RTqPCR（SYBR Green）检测MaEF2在杀虫剂胁迫后的相对表达量。RTqPCR 反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，进行40个循环。荧光定量PCR仪为罗氏LC480，设cDNA样品3次重复，反应结束后采集目标基因和内参基因的 Ct值，利用 2-ΔΔCT相对定量法计算相对表达量[12]。
安徽农业科学2014年1.7数据分析采用DPS软件中的Duncan方法对RTPCR数据进行显著性方差分析。
表1农药规格及稀释浓度
药剂名称生产厂家稀释倍数处理方法5%啶虫脒乳油佛山市大兴生物化工公司900倍液喷雾18%杀虫双水剂中山凯中公司700倍液喷雾2.5%敌杀死拜耳作物科学公司4 000倍液喷雾24%灭多威可溶性液剂江门市大光明农化新会公司240倍液喷雾48%毒死蜱乳油江苏苏州佳辉化工公司1 600倍液喷雾5% 氯氰菊酯乳油邹平县绿大药业公司1 500倍液喷雾40%噻虫啉悬浮剂利民化工股份公司2 000倍液喷雾0.3%印楝素乳油海南利特蒙生物农药公司800倍液喷雾100亿活芽孢/ml BT悬浮剂太原高新技术产业西芮生物公司200倍液口腔注射200亿活孢子/g绿僵菌粉剂厦门多多生物公司1×108个/ul浸泡10 s400亿个孢子/g白僵菌粉剂江西天人生态公司1×108个/ul浸泡10 s对照-清水喷雾
2结果与分析
2.1MaEF2 序列从松墨天牛基因文库中获得EF2 基因的 cDNA，长度为1 184 bp，编码287个氨基酸，命名为MaEF2，核苷酸序3小结与讨论
真核生物的延伸因子2是一种质量为100 000 Da的单体多肽，通过催化依赖于GTP水解的转位反应将A位生成的肽基-tRNA转移到P位，原来P位上空载的tRNA被逐出核糖体，同时，核糖体沿着mRNA向前移动一个密码子[6，13]。目前，已分离获得果蝇、老鼠和仓鼠、甲烷球菌以及小球藻等真核生物的EF2基因[14]，松墨天牛EF2的克隆是首次报道。
EF2 蛋白的主要结构在进化过程中非常保守，經GenBank数据库BLASTN、BLASTX比对表明，推导的 MaEF2 氨基酸序列与其他已知昆虫 EF2 氨基酸序列有 84%～94%的同源性。笔者克隆出的MaEF2基因长度为1 184 bp，编码287个氨基酸，但根据其他昆虫EF2基因全长序列分析，获得的MaEF2可能只是EF2基因全长的部分序列，还缺少3’端约1 kbp的氨基酸序列，但这不影响分析该基因的表达。后期，将进行MaEF2全长基因的克隆，以深入了解松墨天牛EF2的结构和功能。
该研究检测了经杀虫剂胁迫后，EF2 mRNA在松墨天牛成虫中的表达情况，结果显示该基因在啶虫脒作用后的相对表达量最高，为空白对照表达量的11.59倍，其次是杀虫双，为8.02倍，绿僵菌和白僵菌的胁迫作用无显著差异，毒死蜱和灭多威的作用效果较弱。不同杀虫剂作用于MaEF2基因，导致其均有不同程度的上调表达，这可能是松墨天牛产生的自我保护反应。生物有机体细胞适应环境压力的能力是它们生存的关键，生物体在进化过程中使其对环境和生理压力具有一定的应答能力[1]，然而许多应答的共同特点是选择性调节基因的转录和翻译，包括允许可逆基因的快速表达[15-16]。目前研究表明环境压力可诱导 EF2 基因的表达，从而调节蛋白质合成以应对环境条件的变化[17-18]。WANG等[1]研究了凡纳滨对虾EF2 基因在肝胰腺中的相对表达量，结果显示，EF2 基因在酸性条件处理下随着时间的延长呈现先增加后降低再增加的表达趋势；在碱性条件处理下，结果同样是呈现先增加后降低再增加的表达趋势。在环境条件变化下，包括在杀虫剂作用下松墨天牛 EF2 基因的具体功能和作用机制还需进一步研究。
参考文献
[1] WANG L，LIU Y，WANG W N，et al.Molecular characterization and expression analysis of elongation factors 1A and 2 from the Pacific white shrimp，Litopenaeus vannamei[J].Molecular Biology Reports，2011，38（3）：2167-2178. [2] NILSSON J，NISSEN P.Elongation factors on the ribosome[J].Current Opinion in Structural Biology，2005，15（3）：349-354.
[3] PROUD C G.Peptide-chain elongation in eukaryotes[J].Molecular Biology Reports，1994，19（3）：161-170.
[4] ANDERSEN G R，NISSEN P，NYBORG J.Elongation factors in protein biosynthesis[J].Trends in Biochemical Sciences，2003，28（8）：434-441.
[5] WEISSBACH H，OCHOA S.Soluble factors required for eukaryotic protein synthesis[J].Annual Review of Biochemistry，1976，45（1）：191-216.
[6] KOHNO K，UCHIDA T，OHKUBO H，et al.Amino acid sequence of mammalian elongation factor 2 deduced from the cDNA sequence：Homology with GTP-binding proteins[J].Biochemistry，1986，83（14）：4978-4982.
[7] EUN J L，KIM C W.Functional characterization of the promoter region of the chicken elongation factor-2 gene[J].Gene，2007，386（1）：183-190.
[8] MALAVE T M，FORNEY J D.Identification of a developmentally regulated translation elongation factor 2 in Tetrahymena thermophila[J].Gene，2004，326（1）：97-105.
[9] FIGUEIREDOPEREIRA M E，YAKUSHIN S，COHEN G.Accumulation of ubiquitinated proteins in mouse neuronal cells induced by oxidative stress[J].Molecular Biology Reports，1997，24（1）：35-38.
[10] 羅淋淋，韦春梅，林同.松墨天牛分子生物学研究进展[J].中国森林病虫，2014，33（1）：24-28.
[11] 徐金华，黄秀凤，徐华潮，等.松墨天牛室内人工饲养及其生物学特性观察[J].浙江林业科技，2009，29（4）：86-88.
[12] LIVAK K J，SCHMITTGEN T D.Analysis of relative gene expression data using realtime quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method[J].Methods，2001，25（4）：402-408.
[13] GRINBLAT Y，BROWN N H，KAFATOS F C.Isolation and characterization of the DrosoPhila translation elongation factor 2 gene[J].Nucleic Acids Research，1989，17（18）：7301-7314.