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摘要[目的]研究刚毛柽柳水通道蛋白ThPIP基因启动子的克隆及其活性分析。[方法]采用染色体步移技术，克隆到刚毛柽柳ThPIP基因起始密码子上游1 241 bp启动子序列，并通过PLACE和PlantCARE预测启动子序列中所包含的主要顺式作用元件。将该启动子替换pCAMBIA1301上的35S启动子，构建融合表达基因proThPIP∷GUS，通过基因枪瞬时转化烟草，并进行GUS组织化学染色。[结果]该启动子具有活性，能够驱动GUS基因的表达。[结论] 为进一步鉴定该启动子中的顺式作用元件及相互作用的调控因子奠定基础，从而为揭示刚毛柽柳ThPIP基因的分子调控机制提供依据。
关键词刚毛柽柳；ThPIP基因；启动子克隆；瞬时表达
中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611（2014）24-08095-04
Cloning and GUS Activity Analysis of the Promoter of ThPIP Gene from Tamarix hispida
WANG Chao， WANG Yucheng et al（State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding ， Northeast Forestry University ， Harbin ，Heilongjiang 150040）
Abstract[Objective] The aim was to study cloning and GUS activity analysis of the promoter of ThPIP gene from Tamarix hispida. [Method] A 1241 bp promoter sequence of upstream of initial codon of ThPIP gene was obtained from Tamarix hispida by using the genome walking. Sequence analysis of the promoter region revealed several cisactivity elements in the promoter using the PLACE and PlantCARE. Further， the 35S promoter in pCAMBIA1301 was replaced with the ThPIP promoter to drive the βglucuronidase （GUS） gene， the proThPIP∷GUS recombinant construct was generated， which was transient expressed in tabacco leaves by the particle bombardment method. [Result]The histochemical GUS staining showed that the ThPIP promoter had activity and could drive the expression of GUS gene in tabacco leaves.[Conclusion] The study laid the foundation for further identifing the components and regulatory factors of interactions cis， in order to provide the basis for revealing regulatory mechanism of the ThPIP gene.
Key wordsTamarix hispida； ThPIP gene； Promoter cloning； Tansient expression
水通道蛋白（Aquaporins，AQPs），是一類高效特异转运水分子的整合膜蛋白，介导水分跨膜转运，在植物生长发育以及逆境应答中维持细胞渗透平衡具有重要作用[1]。植物AQPs是一个超家族[2]，高等植物AQPs 根据氨基酸序列同源性和亚细胞定位可以分为5 类：质膜内在蛋白（PIPs：plasma membrane intrinsic proteins），液泡膜内在蛋白（TIPs：tonoplast intrinsic proteins），类NOD26内在蛋白（NIPs：NOD26-like intrinsic proteins），小分子碱性膜内在蛋白（SIPs：small basic intrinsic proteins）和未鉴定的膜内在蛋白（XIPs：X intrinsic proteins）[3]。迄今为止，已从多种植物中发现并克隆了编码AQPs的基因，在拟南芥中有35个[4]，水稻中33个[5]，玉米中36个[6]，杨树中54个[7]，烟草、菠菜、马铃薯和胡萝卜等植物中都存在AQP基因[8]。虽然目前已经克隆了多种植物的AQP基因，但关于该基因表达调控方面的研究尚少。因此，对该基因启动子的结构及调控机制的深入研究将为分子育种提高林木抗逆性提供理论基础。
启动子是基因转录起始位点上游的一段DNA序列，包含多种顺式作用元件，能够与转录因子特异性结合直接影响基因的表达量及表达位点，在转录水平上参与调控下游相应基因表达。因此，一定程度上决定了基因表达的时间和空间顺序。常用的启动子按其作用方式及功能分为3类，即组成型启动子、组织特异型启动子和诱导型启动子。目前，在植物表达载体中大多使用组成型启动子，如花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子和胭脂碱氨酸合成酶Nos启动子[9]，使外源基因在植物体内部各部位都表达，在植物转基因育种进程中，逆境诱导型和组织特异型的启动子已成为研究热点[10]。 柽柳（Tamarix sp.）是一种具有良好的抗旱、耐盐能力的木本植物，能在含盐量1%的重盐碱土上生长，显示其具有一套有效的抗逆系统及相应的分子调控机制。目前，尽管已克隆了部分柽柳的抗逆相关基因，并对其功能进行了鉴定，但对抗逆基因启动子的结构和分子调控机制研究极少。笔者利用染色体歩移技术从刚毛柽柳中克隆ThPIP基因上游调控1 241 bp启动子序列，并将该启动子通过PLACE和PlantCARE进行生物信息学分析，预测启动子序列中所包含的主要顺式作用元件。构建融合表达基因proThPIP∷GUS，通过基因枪瞬时转化烟草，并通过GUS组织化学染色分析刚毛柽柳ThPIP基因启动子的活性。为进一步鉴定该启动子中的顺式作用元件及相互作用的调控因子奠定基础，从而为揭示刚毛柽柳ThPIP基因的分子调控机制提供依据。
1材料与方法
1.1试验材料刚毛柽柳（Tamarix hispida）种子采自中国科学院吐鲁番沙漠植物园，将种子栽种在温室中[光照14 h/d，光照强度为400 μmol/（m2·s），温室的相对湿度为65%～75%，平均温度为24 ℃]，其生长基质为草炭土与沙（1∶3）；野生型小叶烟草（Nicotianatabacum）种子由东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室保存。大肠杆菌DH5α感受态、pCAMBIA1301载体质粒、根癌农杆菌（EHA105）菌种为东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室保存。质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒和PCR产物纯化试剂盒购自OMEGA；染色体步移试剂盒（Genome Walking Kit）、pMD18TMT载体、T4 DNA连接酶、LA Taq和DNA Marker DL2000购自TaKaRa公司；dNTP Mixture、DNA序列合成及测序在上海生工生物工程股份有限公司完成。其他药品试剂均为进口或国产分析纯。
1.2试验方法
1.2.1刚毛柽柳基因组DNA 的提取。以温室土培的2月龄整株刚毛柽柳幼苗为材料，采用CTAB法提取整株幼苗的基因组DNA[11]，略有改进。
1.2.2ThPIP基因启动子克隆及序列分析。利用新一代高通量测序Solexa技术建立刚毛柽柳根组织在NaHCO3胁迫下0、6、24和48 h的4个转录组[12]，将获得的Unigenes序列通过NR和SwissProt数据库进行BLASTX比对，得知ThPIP基因全长序列。利用染色体步移试剂盒（Genome Walking Kit），根据已有序列设计3 条特异引物SP1、SP2和SP3，SP2 的位置设计在SP1 的内侧，SP3 位于SP2 的内侧。3条特异引物的序列分别为SP1：5’CTATGAACTCAGCTATACATGC3’，SP2：5’GGAGCTGGTGGTGGATCTAC3’，SP3：5’TCTGTGGAGCTGGCTCTGTC3’；随机引物AP1、AP2、AP3和AP4由试剂盒提供。
参考染色体步移试剂盒提供的说明书，以柽柳基因组DNA为模板，以上述合成的特异引物和随机引物的不同组合为引物，经3轮PCR 反应扩增ThPIP基因上游侧翼序列。PCR扩增的目的条带通过胶回收试剂盒进行纯化回收，回收后的产物与pMDTM18T载体相连，取连接液热激转化大肠杆菌，进行蓝白斑筛选，将鉴定为阳性的菌液通过PCR验证后，再送至上海生工生物工程有限公司进行测序。
利用分子生物学软件PLACE（http：//www.dna.affrc.go.jp）[13]和PlantCARE數据库（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）[14]对测序得到的启动子序列的转录起始位点、潜在的顺式元件等进行预测分析。
2结果与分析
2.1ThPIP基因启动子克隆及序列分析以整株刚毛柽柳幼苗的基因组DNA 为模板，利用染色体步移技术，经过3轮巢式PCR，得到1条长约1.2 kb的片段（图2），胶回收该片段并连接至pMDTM18T 克隆载体上，通过序列测序，发现该序列的3’端87 bp与ThPIP基因相对的Unigene序列完全一致，表明扩增的侧翼序列是ThPIP基因的上游序列，其长度为启动子序列片段1 241 bp。
图4在烟草中瞬时表达的GUS组织化学分析3讨论
植物在生长和发育、生理代谢以及响应逆境胁迫过程中，基因调控主要是在转录水平上进行。这一过程是通过转录因子与启动子上特定的顺式作用元件相互作用，特异性地调控下游基因的表达，进而引发一系列生理、代谢反应，形成高效有序的基因表达调控网络。因而基因启动子中的顺式作用元件则是决定基因表达调控的关键因素，转录因子结合何种顺式作用元件，决定了其调控哪些基因的表达。
启动子在植物基因表达调控研究中具有重要作用，但在没有全基因组测序的情况下，启动子的克隆是一项重要而又艰难的工作，目前有很多克隆启动子的方法，如载体锚定PCR、反向PCR、接头PCR、AdaptorPCR和Tail PCR[20]。柽柳是一种优良的防风固沙植物，耐干旱、盐碱、贫瘠、风蚀和沙埋[21]，是研究木本植物抗逆机理的理想材料。但关于柽柳的基因组信息相对匮乏，该研究使用Tail PCR方法，利用转录组数据中已知的Unigenes序列，高效获取ThPIP基因的侧翼未知序列，相对其他传统方法，该方法具有高效、简便、特异性强、灵敏度高和一次性获得较长未知序列等优点。
研究表明，AQPs基因的表达受盐胁迫诱导，显示其参与植物盐胁迫应答过程[22-23]。此外，AQPs 也参与盐胁迫下其他信号应答调控[24-25]。但其在植物耐盐过程中的调控机理研究相对较少。该研究利用Genome Walking试剂盒克隆了长度1 241 bp的ThPIP基因启动子序列，并利用PLACE和PlantCARE对该序列进行分析，结果发现该启动子除具有启动子的基本核心元件TATAbox，还包含多个与逆境应答有关的顺式调控元件，如MYB1AT、MYBCORE、MYCCONSEN、 WRKY71OS，初步表明该基因可能参与植物的逆境胁迫响应。为了验证该启动子的活性，将其构建到植物表达载体中，代替35S启动子驱动报告基因GUS的表达，基因枪瞬时转化烟草叶片，表明其具有启动子活性，能够驱动GUS基因的表达。为了详细阐述水通道蛋白ThPIP启动子功能，还需要进一步的深入研究，如通过酵母单杂交筛选其上游调控因子，再将启动子上的元件进行突变或者缺失等验证与上游调控因子的互作情况，进而揭示ThPIP基因的功能和分子调控机制。 参考文献
[1] MAUREL C，VERDOUCQ L，LUU D T，et al.Plant aquaporins：membrane channels with multiple integrated functions[J].Annu Rev Plant Biol，2008，59：595-624.
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关键词刚毛柽柳；ThPIP基因；启动子克隆；瞬时表达
中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611（2014）24-08095-04
Cloning and GUS Activity Analysis of the Promoter of ThPIP Gene from Tamarix hispida
WANG Chao， WANG Yucheng et al（State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding ， Northeast Forestry University ， Harbin ，Heilongjiang 150040）
Abstract[Objective] The aim was to study cloning and GUS activity analysis of the promoter of ThPIP gene from Tamarix hispida. [Method] A 1241 bp promoter sequence of upstream of initial codon of ThPIP gene was obtained from Tamarix hispida by using the genome walking. Sequence analysis of the promoter region revealed several cisactivity elements in the promoter using the PLACE and PlantCARE. Further， the 35S promoter in pCAMBIA1301 was replaced with the ThPIP promoter to drive the βglucuronidase （GUS） gene， the proThPIP∷GUS recombinant construct was generated， which was transient expressed in tabacco leaves by the particle bombardment method. [Result]The histochemical GUS staining showed that the ThPIP promoter had activity and could drive the expression of GUS gene in tabacco leaves.[Conclusion] The study laid the foundation for further identifing the components and regulatory factors of interactions cis， in order to provide the basis for revealing regulatory mechanism of the ThPIP gene.
Key wordsTamarix hispida； ThPIP gene； Promoter cloning； Tansient expression
水通道蛋白（Aquaporins，AQPs），是一類高效特异转运水分子的整合膜蛋白，介导水分跨膜转运，在植物生长发育以及逆境应答中维持细胞渗透平衡具有重要作用[1]。植物AQPs是一个超家族[2]，高等植物AQPs 根据氨基酸序列同源性和亚细胞定位可以分为5 类：质膜内在蛋白（PIPs：plasma membrane intrinsic proteins），液泡膜内在蛋白（TIPs：tonoplast intrinsic proteins），类NOD26内在蛋白（NIPs：NOD26-like intrinsic proteins），小分子碱性膜内在蛋白（SIPs：small basic intrinsic proteins）和未鉴定的膜内在蛋白（XIPs：X intrinsic proteins）[3]。迄今为止，已从多种植物中发现并克隆了编码AQPs的基因，在拟南芥中有35个[4]，水稻中33个[5]，玉米中36个[6]，杨树中54个[7]，烟草、菠菜、马铃薯和胡萝卜等植物中都存在AQP基因[8]。虽然目前已经克隆了多种植物的AQP基因，但关于该基因表达调控方面的研究尚少。因此，对该基因启动子的结构及调控机制的深入研究将为分子育种提高林木抗逆性提供理论基础。
启动子是基因转录起始位点上游的一段DNA序列，包含多种顺式作用元件，能够与转录因子特异性结合直接影响基因的表达量及表达位点，在转录水平上参与调控下游相应基因表达。因此，一定程度上决定了基因表达的时间和空间顺序。常用的启动子按其作用方式及功能分为3类，即组成型启动子、组织特异型启动子和诱导型启动子。目前，在植物表达载体中大多使用组成型启动子，如花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子和胭脂碱氨酸合成酶Nos启动子[9]，使外源基因在植物体内部各部位都表达，在植物转基因育种进程中，逆境诱导型和组织特异型的启动子已成为研究热点[10]。 柽柳（Tamarix sp.）是一种具有良好的抗旱、耐盐能力的木本植物，能在含盐量1%的重盐碱土上生长，显示其具有一套有效的抗逆系统及相应的分子调控机制。目前，尽管已克隆了部分柽柳的抗逆相关基因，并对其功能进行了鉴定，但对抗逆基因启动子的结构和分子调控机制研究极少。笔者利用染色体歩移技术从刚毛柽柳中克隆ThPIP基因上游调控1 241 bp启动子序列，并将该启动子通过PLACE和PlantCARE进行生物信息学分析，预测启动子序列中所包含的主要顺式作用元件。构建融合表达基因proThPIP∷GUS，通过基因枪瞬时转化烟草，并通过GUS组织化学染色分析刚毛柽柳ThPIP基因启动子的活性。为进一步鉴定该启动子中的顺式作用元件及相互作用的调控因子奠定基础，从而为揭示刚毛柽柳ThPIP基因的分子调控机制提供依据。
1材料与方法
1.1试验材料刚毛柽柳（Tamarix hispida）种子采自中国科学院吐鲁番沙漠植物园，将种子栽种在温室中[光照14 h/d，光照强度为400 μmol/（m2·s），温室的相对湿度为65%～75%，平均温度为24 ℃]，其生长基质为草炭土与沙（1∶3）；野生型小叶烟草（Nicotianatabacum）种子由东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室保存。大肠杆菌DH5α感受态、pCAMBIA1301载体质粒、根癌农杆菌（EHA105）菌种为东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室保存。质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒和PCR产物纯化试剂盒购自OMEGA；染色体步移试剂盒（Genome Walking Kit）、pMD18TMT载体、T4 DNA连接酶、LA Taq和DNA Marker DL2000购自TaKaRa公司；dNTP Mixture、DNA序列合成及测序在上海生工生物工程股份有限公司完成。其他药品试剂均为进口或国产分析纯。
1.2试验方法
1.2.1刚毛柽柳基因组DNA 的提取。以温室土培的2月龄整株刚毛柽柳幼苗为材料，采用CTAB法提取整株幼苗的基因组DNA[11]，略有改进。
1.2.2ThPIP基因启动子克隆及序列分析。利用新一代高通量测序Solexa技术建立刚毛柽柳根组织在NaHCO3胁迫下0、6、24和48 h的4个转录组[12]，将获得的Unigenes序列通过NR和SwissProt数据库进行BLASTX比对，得知ThPIP基因全长序列。利用染色体步移试剂盒（Genome Walking Kit），根据已有序列设计3 条特异引物SP1、SP2和SP3，SP2 的位置设计在SP1 的内侧，SP3 位于SP2 的内侧。3条特异引物的序列分别为SP1：5’CTATGAACTCAGCTATACATGC3’，SP2：5’GGAGCTGGTGGTGGATCTAC3’，SP3：5’TCTGTGGAGCTGGCTCTGTC3’；随机引物AP1、AP2、AP3和AP4由试剂盒提供。
参考染色体步移试剂盒提供的说明书，以柽柳基因组DNA为模板，以上述合成的特异引物和随机引物的不同组合为引物，经3轮PCR 反应扩增ThPIP基因上游侧翼序列。PCR扩增的目的条带通过胶回收试剂盒进行纯化回收，回收后的产物与pMDTM18T载体相连，取连接液热激转化大肠杆菌，进行蓝白斑筛选，将鉴定为阳性的菌液通过PCR验证后，再送至上海生工生物工程有限公司进行测序。
利用分子生物学软件PLACE（http：//www.dna.affrc.go.jp）[13]和PlantCARE數据库（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）[14]对测序得到的启动子序列的转录起始位点、潜在的顺式元件等进行预测分析。
2结果与分析
2.1ThPIP基因启动子克隆及序列分析以整株刚毛柽柳幼苗的基因组DNA 为模板，利用染色体步移技术，经过3轮巢式PCR，得到1条长约1.2 kb的片段（图2），胶回收该片段并连接至pMDTM18T 克隆载体上，通过序列测序，发现该序列的3’端87 bp与ThPIP基因相对的Unigene序列完全一致，表明扩增的侧翼序列是ThPIP基因的上游序列，其长度为启动子序列片段1 241 bp。
图4在烟草中瞬时表达的GUS组织化学分析3讨论
植物在生长和发育、生理代谢以及响应逆境胁迫过程中，基因调控主要是在转录水平上进行。这一过程是通过转录因子与启动子上特定的顺式作用元件相互作用，特异性地调控下游基因的表达，进而引发一系列生理、代谢反应，形成高效有序的基因表达调控网络。因而基因启动子中的顺式作用元件则是决定基因表达调控的关键因素，转录因子结合何种顺式作用元件，决定了其调控哪些基因的表达。
启动子在植物基因表达调控研究中具有重要作用，但在没有全基因组测序的情况下，启动子的克隆是一项重要而又艰难的工作，目前有很多克隆启动子的方法，如载体锚定PCR、反向PCR、接头PCR、AdaptorPCR和Tail PCR[20]。柽柳是一种优良的防风固沙植物，耐干旱、盐碱、贫瘠、风蚀和沙埋[21]，是研究木本植物抗逆机理的理想材料。但关于柽柳的基因组信息相对匮乏，该研究使用Tail PCR方法，利用转录组数据中已知的Unigenes序列，高效获取ThPIP基因的侧翼未知序列，相对其他传统方法，该方法具有高效、简便、特异性强、灵敏度高和一次性获得较长未知序列等优点。
研究表明，AQPs基因的表达受盐胁迫诱导，显示其参与植物盐胁迫应答过程[22-23]。此外，AQPs 也参与盐胁迫下其他信号应答调控[24-25]。但其在植物耐盐过程中的调控机理研究相对较少。该研究利用Genome Walking试剂盒克隆了长度1 241 bp的ThPIP基因启动子序列，并利用PLACE和PlantCARE对该序列进行分析，结果发现该启动子除具有启动子的基本核心元件TATAbox，还包含多个与逆境应答有关的顺式调控元件，如MYB1AT、MYBCORE、MYCCONSEN、 WRKY71OS，初步表明该基因可能参与植物的逆境胁迫响应。为了验证该启动子的活性，将其构建到植物表达载体中，代替35S启动子驱动报告基因GUS的表达，基因枪瞬时转化烟草叶片，表明其具有启动子活性，能够驱动GUS基因的表达。为了详细阐述水通道蛋白ThPIP启动子功能，还需要进一步的深入研究，如通过酵母单杂交筛选其上游调控因子，再将启动子上的元件进行突变或者缺失等验证与上游调控因子的互作情况，进而揭示ThPIP基因的功能和分子调控机制。 参考文献
[1] MAUREL C，VERDOUCQ L，LUU D T，et al.Plant aquaporins：membrane channels with multiple integrated functions[J].Annu Rev Plant Biol，2008，59：595-624.
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[6] CHAUMONT F，BARRIEU F，WOJCIK E，et al.Aquaporins constitute a large and highly divergent protein family in maize[J].Plant Physio1，2001，25（3）：1206-1215.
[7] GUPTA A B，SANKARARAMAKRISHNAN R.Genomewide analysis of major intrinsic proteins in the tree plant Populus trichocarpa：characterization of XIP subfamily of aquaporins from evolutionary perspective[J].BMC Plant Biol，2009，9（1）：134.
[8] LUDEWIG U，DYNOWSKI M.Plant aquaporin selectivity：where transport assays，computer simulations and physiology meet[J].Cell Mol Life Sci，2009，66（19）：3161-3175.
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