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摘 要：为了优化板栗壳中的黄酮类成分的提取工艺，分别采用不同溶剂、不同提取方式浸提板栗壳中的黄酮成分，并选取提取次数、加醇量（料液比）、提取时间、醇浓度作为考察因素，设计正交实验对提取工艺进行优化，以芦丁为标准品，硝酸铝-亚硝酸钠比色法，用可见-紫外分光光度计检测提取物中总黄酮的含量，比较总黄酮提取物的收得率，优选最佳提取工艺。结果表明，当选用60%乙醇回流提取，提取2次，加醇量为10倍量，提取时间为1.5 h时板栗壳总黄酮提取率最高，平均提取率为19.36%。
关键词：板栗壳;黄酮;提取工艺
板栗壳为壳斗科植物板栗（Castanea mollissima Bl.）的干燥外果皮，除青海、新疆以外，在辽宁以南各省（市、区）均有栽培，作为中药收载于《中华人民共和国药典 四部》（2015年版）中[1]，其药性甘、涩、平，具有降逆化痰、清热散结、止血之功效，常用于治疗反胃、消渴、咳痰、瘰疬、衄血、便血及腮腺炎等。
板栗壳为板栗的带刺毛壳，即板栗总苞。历代“本草”对其称呼不同，《证类本草》中称其为“栗毛壳”，《滇南本草》中称其为“子上壳刺”，《本草纲目》《中华本草》《中药大辞典》中均称其为“栗毛球”，江西《草药手册》中称其为“板栗壳斗”，《中国药典》中称其为“板栗壳”，至今，各名称均有不同程度沿用。
近年研究表明，板栗壳含有丰富的黄酮、多糖、酚类等成分[2-4]，文献报道栗壳中含有丰富的天然棕色素，属于黄酮类，不仅可广泛用于食品、日用化学品和药品的着色剂，现代药理研究还显示栗壳黄酮具有抗菌、抗氧化、自由基清除等多方面作用[5-7]，故本课题系统研究并优化板栗壳中黄酮类成分的提取工艺，为其工业化规模生产提供依据。
1 仪器与试剂
板栗，济南市售。
电热恒温水浴锅（上海医疗器械五厂）;FA 2004分析天平（上海第二分析仪器厂）;TU-1810紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）;KQE-400B型超声清洗机（济南巴克超声波科技有限公司）;KFS-C2电子天平（凯丰集团）。
无水乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、芦丁标准品。
2 方法与结果
2.1 黄酮成分测定
采用硝酸铝-亚硝酸钠比色法，以芦丁为标准品绘制标准曲线。准确吸取芦丁标准溶液0.00 mL、0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、1.50 mL和2.00 mL（相当于芦丁0 μg、75 μg、150 μg、300 μg、450 μg和600 μg），加蒸餾水补足至2 mL，各加入30%乙醇溶液4 mL和5%亚硝酸钠溶液0.5 mL，振摇后放置5 min，加入10%硝酸铝溶液0.5 mL，摇匀后放置6 min，加1.0 mol/L氢氧化钠溶液4 mL，摇匀，放置15 min，于510 nm波长处测定吸光度，以零管为空白，以吸光度A为纵坐标、芦丁含量C（μg/mL）为横坐标绘制标准曲线，得到曲线方程为A=11.67C-0.016 6，相关系数R2=0.999 1，芦丁溶液的浓度在0.017～0.104 μg/mL范围内与吸光度呈良好的线性关系。
样品测定。取2 mL样品按照标准曲线绘制的操作步骤进行检测，同样于510 nm处进行吸光度的测定。
2.2 工艺流程
将板栗壳洗净后放于60 ℃烘箱中烘干，粉碎，过40目筛，精密称取栗壳粉样品2 g，加入一定体积的溶剂，在相应温度水浴和浸提时间内浸提，浸提液经5 000 r/min离心15 min，取上清液，定容至40 mL，放置于4 ℃冰箱中贮存备用。
2.3 不同溶剂浸提产率
分别采用水、75%乙醇、正丁醇、乙酸乙酯为溶剂浸提板栗壳中的黄酮成分，将提取成分纯化后用超纯水定容至100 mL作为供试品试液，按照2.1的方法，测定吸光度，根据标准曲线的回归方程得出不同浸提液中黄酮的浓度，根据公式（1）计算黄酮得率。
（1）
式（1）中，W为总黄酮产率，%，C为测定总黄酮的浓度，mg/mL，D为稀释倍数，V为供试液的体积，mL，M为板栗壳的质量，g。
不同溶剂浸提板栗壳总黄酮产率见表1。从表1可以看出，乙醇作为溶剂提取黄酮的产率最高。
2.4 不同浓度乙醇提取黄酮产率
精确称取板栗壳粉样品2.00 g共18份，置于100 mL具塞锥形瓶中，分别加入25 mL 35%、45%、55%、65%、75%和85%的乙醇溶液，每个处理重复3次。各组样品均在室温下浸泡24 h，之后减压、抽滤，滤液放置于旋转蒸发仪上减压蒸干，温度控制在60 ℃以下。将蒸干的样品称重，干浸膏用30%乙醇超声溶解，转移至10 mL容量瓶中，并用30%乙醇定容至刻度，摇匀后测定，按公式（1）计算黄酮产率。实验结果见表2，从表2可以看出，55%乙醇提取的黄酮产率最高。
2.5 不同提取方法提取黄酮产率
（1）回流提取法。精确称取板栗壳粉样品2.00 g，置于250 mL平底烧瓶中，加入25.0 mL的55%乙醇溶液，浸泡20 min后加热回流提取30 min，放冷，减压抽滤，滤液放置于旋转蒸发仪中减压蒸干，温度控制在60 ℃以下，干浸膏用30%乙醇超声溶解，转移至25 mL容量瓶中，用30%乙醇定容至刻度，摇匀，测定黄酮产率。平行测定4份，计算平均产率。
（2）超声提取法。精确称取板栗壳粉样品2.00 g，置于100 mL具塞锥形瓶中，加入25.0 mL 55%的乙醇，浸泡20 min后在超声波清洗仪上室温超声30 min，超声完毕后减压抽滤，滤液放置于旋转蒸发仪中减压蒸干，温度控制在60 ℃以下，向干浸膏中加入适量30%乙醇超声溶解，转移至25 mL量瓶中，用30%乙醇定容至刻度，摇匀，测定黄酮产率。平行测定4份，计算平均产率。 （3）微波辅助提取法。精确称取板栗壳粉样品2.00 g，置于250 mL具塞锥形瓶中，加入25.0 mL 55%的乙醇，浸泡55 min（保证样品与浸提溶剂接触的总时间与其他方法一致），再用微波中火提取5 min（提取中每隔1～2 min停30 s），放冷，减压抽滤，滤液放置于旋转蒸发仪中减压蒸干，温度控制在60 ℃以下，干浸膏用30%乙醇超声溶解，转移至25 ml量瓶中，用30%乙醇定容至刻度，摇匀，测定黄酮产率。平行测定4份，计算平均产率。
实验结果见表3，由表3可以看出，55%乙醇回流提取的黄酮产率最高。
2.6 正交设计
影响板栗壳总黄酮含量的因素主要有提取次数、加醇量（倍量）、提取时间、醇浓度，故以这4个影响因素的3个水平，采用L9（34）正交表设计进行实验，考察板栗壳中总黄酮的含量，结果见表4和表5。
由表5的正交试验数据结果可以看出，影响总黄酮含量提取的4个因素按顺序为D>B>C>A，即提取醇浓度>加醇量>提取时间>提取次数。通过4因素3水平的考察，得出最佳提取条件为A1B3C3D3，即提取1次，加醇量为10倍量，提取时间1.5 h，提取醇浓度60%时，所得板栗壳总黄酮含量最高，为19.21%。通过方差分析表6可见，因素D、B、C对试验结果有显著性影响，综合分析实验条件后选择A2B3C3D3为最佳提取条件，即采用60%醇提取法，提取2次，加醇量为10倍量，提取时间1.5 h。在以上工艺优选条件下重复实验3次，平均提取率为19.36%。
3 讨论
板栗营养价值丰富，口感美味，受到广大人民的喜爱，在全国栽培广泛，但板栗壳目前大多被当作废弃物丢弃，造成了资源的浪费，主要原因是人们并未意识到板栗壳的价值所在，对板栗壳的开发利用也未普及推广。党的十八大提出了建设环境友好型、资源节约型社会的要求，加强板栗壳的开发利用也正是响应国家号召的一大举措。
本文通过前期对板栗壳的药理作用的文献查阅，发现越来越多的科研人员开始重视板栗壳的重大开发价值，对板栗壳的研究也越来越多，通过研究人们发现了板栗壳具有的许多药理作用，包括抗菌抗炎、抗氧化、抗肿瘤、降血糖降血脂和改善脑缺血等人们非常关注的一些作用，当然具体的临床应用还需要进一步的研究。
在本实验研究中通过对不同溶剂浸提板栗壳中的黄酮成分，比较总黄酮提取物的收得率，优选最佳提取溶剂为55%乙醇提取;通過不同提取方式的研究确定了最佳提取方式为55%乙醇回流提取;通过对影响实验的4个因素3个水平的正交试验最终确定了最佳提取工艺为选用60%的乙醇回流提取，加醇量为10倍量，提取次数为2次，提取时间为1.5 h，此时板栗壳总黄酮提取率最高，为19.36%。本研究为工业化规模生产及促进栗壳的临床药用提供了理论依据。
参考文献
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典 四部[M].北京：中国医药科技出版社，2015.
[2]刘义庆.板栗壳中黄酮类生物活性成分的提取与微乳薄层分离分析[J].江汉大学学报（自然科学版），2008，36（4）：33-35.
[3]冉靓，武子敬，冉阳，等.大孔吸附树脂纯化板栗壳总黄酮的研究[J].安徽农业科学，2013，41（2）：827-829.
[4]何珊珊.板栗壳的化学成分研究[D].成都：西南交通大学，2015.
[5]李云雁，宋光森.板栗壳色素抗氧化性研究[J].中国油脂，2004（5）：46-48.
[6]刘平，李云雁，罗渊，等.板栗壳棕色素对活性氧自由基的清除作用[J].食品科技，2008（2）：175-178.
[7]石恩慧，郭凯军，李红，等.板栗总苞多酚提取工艺优化及其抗氧化性研究[J].动物营养学报，2013，25（2）：406-414.
关键词：板栗壳;黄酮;提取工艺
板栗壳为壳斗科植物板栗（Castanea mollissima Bl.）的干燥外果皮，除青海、新疆以外，在辽宁以南各省（市、区）均有栽培，作为中药收载于《中华人民共和国药典 四部》（2015年版）中[1]，其药性甘、涩、平，具有降逆化痰、清热散结、止血之功效，常用于治疗反胃、消渴、咳痰、瘰疬、衄血、便血及腮腺炎等。
板栗壳为板栗的带刺毛壳，即板栗总苞。历代“本草”对其称呼不同，《证类本草》中称其为“栗毛壳”，《滇南本草》中称其为“子上壳刺”，《本草纲目》《中华本草》《中药大辞典》中均称其为“栗毛球”，江西《草药手册》中称其为“板栗壳斗”，《中国药典》中称其为“板栗壳”，至今，各名称均有不同程度沿用。
近年研究表明，板栗壳含有丰富的黄酮、多糖、酚类等成分[2-4]，文献报道栗壳中含有丰富的天然棕色素，属于黄酮类，不仅可广泛用于食品、日用化学品和药品的着色剂，现代药理研究还显示栗壳黄酮具有抗菌、抗氧化、自由基清除等多方面作用[5-7]，故本课题系统研究并优化板栗壳中黄酮类成分的提取工艺，为其工业化规模生产提供依据。
1 仪器与试剂
板栗，济南市售。
电热恒温水浴锅（上海医疗器械五厂）;FA 2004分析天平（上海第二分析仪器厂）;TU-1810紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）;KQE-400B型超声清洗机（济南巴克超声波科技有限公司）;KFS-C2电子天平（凯丰集团）。
无水乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、芦丁标准品。
2 方法与结果
2.1 黄酮成分测定
采用硝酸铝-亚硝酸钠比色法，以芦丁为标准品绘制标准曲线。准确吸取芦丁标准溶液0.00 mL、0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、1.50 mL和2.00 mL（相当于芦丁0 μg、75 μg、150 μg、300 μg、450 μg和600 μg），加蒸餾水补足至2 mL，各加入30%乙醇溶液4 mL和5%亚硝酸钠溶液0.5 mL，振摇后放置5 min，加入10%硝酸铝溶液0.5 mL，摇匀后放置6 min，加1.0 mol/L氢氧化钠溶液4 mL，摇匀，放置15 min，于510 nm波长处测定吸光度，以零管为空白，以吸光度A为纵坐标、芦丁含量C（μg/mL）为横坐标绘制标准曲线，得到曲线方程为A=11.67C-0.016 6，相关系数R2=0.999 1，芦丁溶液的浓度在0.017～0.104 μg/mL范围内与吸光度呈良好的线性关系。
样品测定。取2 mL样品按照标准曲线绘制的操作步骤进行检测，同样于510 nm处进行吸光度的测定。
2.2 工艺流程
将板栗壳洗净后放于60 ℃烘箱中烘干，粉碎，过40目筛，精密称取栗壳粉样品2 g，加入一定体积的溶剂，在相应温度水浴和浸提时间内浸提，浸提液经5 000 r/min离心15 min，取上清液，定容至40 mL，放置于4 ℃冰箱中贮存备用。
2.3 不同溶剂浸提产率
分别采用水、75%乙醇、正丁醇、乙酸乙酯为溶剂浸提板栗壳中的黄酮成分，将提取成分纯化后用超纯水定容至100 mL作为供试品试液，按照2.1的方法，测定吸光度，根据标准曲线的回归方程得出不同浸提液中黄酮的浓度，根据公式（1）计算黄酮得率。
（1）
式（1）中，W为总黄酮产率，%，C为测定总黄酮的浓度，mg/mL，D为稀释倍数，V为供试液的体积，mL，M为板栗壳的质量，g。
不同溶剂浸提板栗壳总黄酮产率见表1。从表1可以看出，乙醇作为溶剂提取黄酮的产率最高。
2.4 不同浓度乙醇提取黄酮产率
精确称取板栗壳粉样品2.00 g共18份，置于100 mL具塞锥形瓶中，分别加入25 mL 35%、45%、55%、65%、75%和85%的乙醇溶液，每个处理重复3次。各组样品均在室温下浸泡24 h，之后减压、抽滤，滤液放置于旋转蒸发仪上减压蒸干，温度控制在60 ℃以下。将蒸干的样品称重，干浸膏用30%乙醇超声溶解，转移至10 mL容量瓶中，并用30%乙醇定容至刻度，摇匀后测定，按公式（1）计算黄酮产率。实验结果见表2，从表2可以看出，55%乙醇提取的黄酮产率最高。
2.5 不同提取方法提取黄酮产率
（1）回流提取法。精确称取板栗壳粉样品2.00 g，置于250 mL平底烧瓶中，加入25.0 mL的55%乙醇溶液，浸泡20 min后加热回流提取30 min，放冷，减压抽滤，滤液放置于旋转蒸发仪中减压蒸干，温度控制在60 ℃以下，干浸膏用30%乙醇超声溶解，转移至25 mL容量瓶中，用30%乙醇定容至刻度，摇匀，测定黄酮产率。平行测定4份，计算平均产率。
（2）超声提取法。精确称取板栗壳粉样品2.00 g，置于100 mL具塞锥形瓶中，加入25.0 mL 55%的乙醇，浸泡20 min后在超声波清洗仪上室温超声30 min，超声完毕后减压抽滤，滤液放置于旋转蒸发仪中减压蒸干，温度控制在60 ℃以下，向干浸膏中加入适量30%乙醇超声溶解，转移至25 mL量瓶中，用30%乙醇定容至刻度，摇匀，测定黄酮产率。平行测定4份，计算平均产率。 （3）微波辅助提取法。精确称取板栗壳粉样品2.00 g，置于250 mL具塞锥形瓶中，加入25.0 mL 55%的乙醇，浸泡55 min（保证样品与浸提溶剂接触的总时间与其他方法一致），再用微波中火提取5 min（提取中每隔1～2 min停30 s），放冷，减压抽滤，滤液放置于旋转蒸发仪中减压蒸干，温度控制在60 ℃以下，干浸膏用30%乙醇超声溶解，转移至25 ml量瓶中，用30%乙醇定容至刻度，摇匀，测定黄酮产率。平行测定4份，计算平均产率。
实验结果见表3，由表3可以看出，55%乙醇回流提取的黄酮产率最高。
2.6 正交设计
影响板栗壳总黄酮含量的因素主要有提取次数、加醇量（倍量）、提取时间、醇浓度，故以这4个影响因素的3个水平，采用L9（34）正交表设计进行实验，考察板栗壳中总黄酮的含量，结果见表4和表5。
由表5的正交试验数据结果可以看出，影响总黄酮含量提取的4个因素按顺序为D>B>C>A，即提取醇浓度>加醇量>提取时间>提取次数。通过4因素3水平的考察，得出最佳提取条件为A1B3C3D3，即提取1次，加醇量为10倍量，提取时间1.5 h，提取醇浓度60%时，所得板栗壳总黄酮含量最高，为19.21%。通过方差分析表6可见，因素D、B、C对试验结果有显著性影响，综合分析实验条件后选择A2B3C3D3为最佳提取条件，即采用60%醇提取法，提取2次，加醇量为10倍量，提取时间1.5 h。在以上工艺优选条件下重复实验3次，平均提取率为19.36%。
3 讨论
板栗营养价值丰富，口感美味，受到广大人民的喜爱，在全国栽培广泛，但板栗壳目前大多被当作废弃物丢弃，造成了资源的浪费，主要原因是人们并未意识到板栗壳的价值所在，对板栗壳的开发利用也未普及推广。党的十八大提出了建设环境友好型、资源节约型社会的要求，加强板栗壳的开发利用也正是响应国家号召的一大举措。
本文通过前期对板栗壳的药理作用的文献查阅，发现越来越多的科研人员开始重视板栗壳的重大开发价值，对板栗壳的研究也越来越多，通过研究人们发现了板栗壳具有的许多药理作用，包括抗菌抗炎、抗氧化、抗肿瘤、降血糖降血脂和改善脑缺血等人们非常关注的一些作用，当然具体的临床应用还需要进一步的研究。
在本实验研究中通过对不同溶剂浸提板栗壳中的黄酮成分，比较总黄酮提取物的收得率，优选最佳提取溶剂为55%乙醇提取;通過不同提取方式的研究确定了最佳提取方式为55%乙醇回流提取;通过对影响实验的4个因素3个水平的正交试验最终确定了最佳提取工艺为选用60%的乙醇回流提取，加醇量为10倍量，提取次数为2次，提取时间为1.5 h，此时板栗壳总黄酮提取率最高，为19.36%。本研究为工业化规模生产及促进栗壳的临床药用提供了理论依据。
参考文献
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典 四部[M].北京：中国医药科技出版社，2015.
[2]刘义庆.板栗壳中黄酮类生物活性成分的提取与微乳薄层分离分析[J].江汉大学学报（自然科学版），2008，36（4）：33-35.
[3]冉靓，武子敬，冉阳，等.大孔吸附树脂纯化板栗壳总黄酮的研究[J].安徽农业科学，2013，41（2）：827-829.
[4]何珊珊.板栗壳的化学成分研究[D].成都：西南交通大学，2015.
[5]李云雁，宋光森.板栗壳色素抗氧化性研究[J].中国油脂，2004（5）：46-48.
[6]刘平，李云雁，罗渊，等.板栗壳棕色素对活性氧自由基的清除作用[J].食品科技，2008（2）：175-178.
[7]石恩慧，郭凯军，李红，等.板栗总苞多酚提取工艺优化及其抗氧化性研究[J].动物营养学报，2013，25（2）：406-414.