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摘 要：菌落总数是判定食品被细菌污染程度的一个重要指标，糕点作为食品中的大类，菌落总数超标的情况较多，本文从糕点的加工工艺入手，分析菌落总数不合格的根本原因，分析糕点所使用的主要原料以及各个环节的污染源，并结合全基因组测序及溯源技术，为微生物的污染溯源分析及污染控制提出了针对性措施。
关键词：菌落总数;糕点;食品安全
菌落总数是食品微生物检测中一个非常重要的指标，主要用于判定食品被细菌污染的程度，反映食品检样的质量及安全情况。对于菌落总数的检测，通常依据GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验菌落总数测定》，该标准中对于菌落总数的定义为“食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后，所得每g（mL）检样中形成的微生物菌落总数”[1-3]。即需氧情况下，（36±1）℃培养（48±2）h，在平板计数琼脂上生长的微生物菌落总数。由此可知，专性厌氧菌、微需氧菌、有特殊营养要求的细菌以及非嗜中温细菌，培养条件无法满足其生理需求，难以繁殖生长，因此，菌落总数并不一定代表被测样品中的微生物总数，或者可以说菌落总数的检测结果不一定能反映食品被微生物污染的程度，这种情况可能在一些真空包装食品中可能存在，即该样品已受厌氧菌污染变质，但菌落总数检验指标却合格。在美国分析化学家协会（Association of Official Analytical Chemists，AOAC）以及美国食品药品监督管理局微生物分析方法（Bacteriological Analytical Manual，BAM）中通常称为Aerobic Count Plate，也就是需氧菌总数[4-5]。
就各类食品而言，糕点是菌落总数不合格率比较高的，其菌落总数不合格的原因各有不同。其中，又以烘烤类糕点中面包、水蒸糕点以及冷加工糕点中蛋糕，菌落总数不合格率最高。分析糕点菌落总数不合格原因可从糕点的加工工艺着手，依据糕点通则《GB/T 20977—2007》可知，糕点可分为热加工糕点与冷加工糕点，热加工糕点包括烘烤糕点、油炸糕点、水蒸糕点、熟粉糕点及其他热加工糕点[6-7]。冷加工糕点包括冷调韧糕类、冷调松糕类、蛋糕、油炸上糖浆类、萨其马类及其他冷加工糕点。
本文结合糕点所使用的主要原料，冷加工、热加工等加工工艺特点，分析糕点中菌落总数不合格的原因，研究糕点中微生物溯源及鉴定，并针对性提出原料控制、生产过程控制、人员控制、环境控制、包装材料控制等复合防控措置，为污染菌的防控提出了具有建设性的建议。
1 糕点菌落总数不合格原因分析
造成糕点菌落总数指标不合格的原因很多，需根据糕点类别、加工工艺、所用原料，具體问题具体分析，有部分面包，如软式面包、硬式面包和起酥面包，是因为所采用的小麦粉受细菌污染，菌落总数过高，而加热时间或加热温度不够，导致面包中心温度达不到90 ℃，从而造成生产出的面包菌落总数超标;而调理面包，如添加了奶油、黄油、可可、果酱等原料，或添加肉松、火腿肠等肉制品的面包，菌落总数不合格的概率更高，可能是由于添加原料受细菌污染，且是加热冷却后加入，或加入馅料后，加热时间或加热温度不够，导致菌落总数不合格;有些中式糕点如酥皮油炸糕点中添加火腿、玫瑰花或其他馅料，因为加热不充分，中心温度不足以杀死细菌，导致菌落总数不合格。蛋糕等冷加工糕点对生产工艺的要求更高，不合格原因可能是因为粉浆用量与烘烤时间温度不匹配，导致杀菌不彻底，另外来自传输带等生产工具、操作人员、包装袋的污染也是主要原因。因此，糕点中污染菌的控制，特别要注意主要人员操作、环境污染以及原料带入污染等[8-9]。
2 糕点中细菌污染溯源
对于糕点中污染菌溯源，有多项技术：①传统的细菌分离以及生化鉴定技术;②多位点序列分型（Multi Locus Sequence Typing，MLST）技术，比较管家基因的区别以分析不同菌株的遗传相关性及差异性，通过对管家基因进行PCR扩増、测序、等位基因对比，得到分离株的ST（Sequence Type，ST）型，以获取菌株之间的亲缘关系实现溯源;③脉冲场凝胶电泳（Pulsed Field Gel Electrophoresis，PFGE）分型技术，将菌体裂解后，选取合适的限制性内切酶对基因组DNA进行酶切，经脉冲场凝胶电泳分离，根据电泳条带的差异性进行分型。近年来，随着新一代基因组测序技术的发展，基于全基因组测序（Whole Genome Sequencing，WGS）的分子分型技术在细菌污染溯源调查中显示出巨大的优势与发展潜力，即采用二代测序技术对细菌进行全基因组测序，统计分析单拷贝直系同源基因，构建系统进化树，溯源结果更清晰明确。可采用多种手段与方法，分析污染源，这更有利于消除污染，排除风险，保证食品安全。目前欧美国家均已开展食品、饮用水中微生物的采集与全基因组测序，通过建立微生物全基因组数据库实现精准溯源，如美国食品药品监督管理局建立了GenomeTrakr、欧盟食品安全专家委员会开展了基因组溯源分析[10]。
3 糕点中细菌污染防治
《食品安全法》规定食品生产经营者是食品安全的第一负责人，当发现生产产品菌落总数不合格时，企业应高度重视，仔细分析不合格原因，对所用到的每一种原辅料进行排查，细化到品种、使用量，排除原辅料导致菌落总数不合格的原因;对加热烘烤或油炸过程，要特别关注加热温度的监测，加热时间的控制，同时还不能忽略粉浆用量，同样的加热温度、加热时间，如果个别产品粉浆用量多，会导致中心温度而不足以杀灭细菌;而对于冷却与包装，更重要的是关注加工环境、加工工具、加工人员等的污染，应加强环境、加工工具与加工人员的卫生控制。冷却包装车间应定期监测浮游菌、沉降菌、悬浮粒子及卫生状况，检测方法可参考《医药工业洁净室（区）浮游菌的测试方法》（GB/T 16293—2010）[11]、《医药工业洁净室（区）沉降菌的测试方法》（GB/T 16294—2010）[12]、《医药工业洁净室（区）悬浮粒子的测试方法》（GB/T 16292—2010）[13];对于加工工具如传输带、包装机，对于工作人员手部、包装材料内表面，应定期进行涂抹实验，监测项目包括菌落总数、大肠菌群、金黄色葡萄球菌等，一旦发现细菌污染或其他异常情况，应立即停止生产排查原因。另外生产车间需做好防蝇、防虫、防鼠等必要的卫生防范措施。运输环节，需有专用的运输设备及工具，有冷藏需要的，还要配备冷链环节，以确保运输途中不受污染[14-15]。 4 结语
菌落总数是判定食品被微生物污染程度的一个重要指标，糕点作为食品中的大类，菌落总数超标的情况较多，也就是说，糕点中微生物污染的情况较为普遍。为了提高糕点质量，解决糕点的食品安全问题，糕点中微生物污染就不能回避。依据《糕点通则》（GB/T 20977—2007）可知，糕点可分为热加工糕点与冷加工糕点。本文从糕点的生产流程入手，分析糕点所使用的主要原料以及各个环节的污染源，并结合全基因组测序及溯源技术，為微生物的污染溯源分析提出了新的解决方法，同时微生物污染源控制如：原辅料采购验收，生产过程工艺控制，加工工具与加工人员的卫生控制，加工环境污染控制，传输带、包装材料与包装机卫生清洁等提出了针对性的污染控制措施。
参考文献
[1]陈怡文，周巍，崔生辉，等.食品安全国家标准中菌落总数测定方法影响因素分析[J].食品安全质量检测学报，2018，9（21）：5642-5646.
[2]许金榜.食品微生物实验室菌落总数能力验证与质量控制浅析[J].现代食品，2019，20：184-187.
[3]国家卫生和计划生育委员会，国家食品药品监督管理总局.食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定：GB 4789.2—2016[S].北京：中国标准出版社，2016.
[4]侯维维.食品抽检菌落总数超标产生原因及对策分析[J].中国食品药品监管，2018（5）：48-50.
[5]赵立冬，赵红阳，石业娇，等.3MTM PetrifilmTM快速菌落总数测试片法与食品中菌落总数检测国标方法（GB 4789.2—2010）的比较[J].中国微生态学杂志，2018，30（10）：1203-1210.
[6]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员 会.糕点通则：GB/T 20977— 2007 [S].北京：中国标准出版社，2007.
[7]王永杰.无包装糕点中菌落总数的生长情况[J].中国卫生产业，2020，17（7）：152-155.
[8]徐建芬.糕点微生物防控和检验[J].现代食品，2016（11）：64-65.
[9]徐斐，刘莉萍，何定兵.糕点、面包中污染细菌的分离及菌种的初步鉴定[J].工业微生物，2007（2）：45-48.
[10]崔生辉，赵琳娜，路勇.食品微生物追踪溯源网络分析探讨[J].食品安全质量检测学报，2018，9（13）：3514-3517.
[11]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.医药工业洁净室（区）浮游菌的测试方法：GB/T 16293—2010[S].北京：中国标准出版社，2010.
[12]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.医药工业洁净室（区）沉降菌的测试方法：GB/T 16294—2010[S].北京：中国标准出版社，2010.
[13]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.医药工业洁净室（区）悬浮粒子的测试方法：GB/T 16292—2010[S].北京：中国标准出版社，2010.
[14]崔莹，李艳芬，张秀丽，等.河南省散装糕点微生物污染状况调查及分析[J].中国卫生检验杂志，2014，24（12）：1780-1782.
[15]陈健皓.沙门氏菌快速检测方法的筛选与应用和鸡源、猪源菌株MLST分子溯源及耐药性研究[D].扬州：扬州大学，2017.
关键词：菌落总数;糕点;食品安全
菌落总数是食品微生物检测中一个非常重要的指标，主要用于判定食品被细菌污染的程度，反映食品检样的质量及安全情况。对于菌落总数的检测，通常依据GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验菌落总数测定》，该标准中对于菌落总数的定义为“食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后，所得每g（mL）检样中形成的微生物菌落总数”[1-3]。即需氧情况下，（36±1）℃培养（48±2）h，在平板计数琼脂上生长的微生物菌落总数。由此可知，专性厌氧菌、微需氧菌、有特殊营养要求的细菌以及非嗜中温细菌，培养条件无法满足其生理需求，难以繁殖生长，因此，菌落总数并不一定代表被测样品中的微生物总数，或者可以说菌落总数的检测结果不一定能反映食品被微生物污染的程度，这种情况可能在一些真空包装食品中可能存在，即该样品已受厌氧菌污染变质，但菌落总数检验指标却合格。在美国分析化学家协会（Association of Official Analytical Chemists，AOAC）以及美国食品药品监督管理局微生物分析方法（Bacteriological Analytical Manual，BAM）中通常称为Aerobic Count Plate，也就是需氧菌总数[4-5]。
就各类食品而言，糕点是菌落总数不合格率比较高的，其菌落总数不合格的原因各有不同。其中，又以烘烤类糕点中面包、水蒸糕点以及冷加工糕点中蛋糕，菌落总数不合格率最高。分析糕点菌落总数不合格原因可从糕点的加工工艺着手，依据糕点通则《GB/T 20977—2007》可知，糕点可分为热加工糕点与冷加工糕点，热加工糕点包括烘烤糕点、油炸糕点、水蒸糕点、熟粉糕点及其他热加工糕点[6-7]。冷加工糕点包括冷调韧糕类、冷调松糕类、蛋糕、油炸上糖浆类、萨其马类及其他冷加工糕点。
本文结合糕点所使用的主要原料，冷加工、热加工等加工工艺特点，分析糕点中菌落总数不合格的原因，研究糕点中微生物溯源及鉴定，并针对性提出原料控制、生产过程控制、人员控制、环境控制、包装材料控制等复合防控措置，为污染菌的防控提出了具有建设性的建议。
1 糕点菌落总数不合格原因分析
造成糕点菌落总数指标不合格的原因很多，需根据糕点类别、加工工艺、所用原料，具體问题具体分析，有部分面包，如软式面包、硬式面包和起酥面包，是因为所采用的小麦粉受细菌污染，菌落总数过高，而加热时间或加热温度不够，导致面包中心温度达不到90 ℃，从而造成生产出的面包菌落总数超标;而调理面包，如添加了奶油、黄油、可可、果酱等原料，或添加肉松、火腿肠等肉制品的面包，菌落总数不合格的概率更高，可能是由于添加原料受细菌污染，且是加热冷却后加入，或加入馅料后，加热时间或加热温度不够，导致菌落总数不合格;有些中式糕点如酥皮油炸糕点中添加火腿、玫瑰花或其他馅料，因为加热不充分，中心温度不足以杀死细菌，导致菌落总数不合格。蛋糕等冷加工糕点对生产工艺的要求更高，不合格原因可能是因为粉浆用量与烘烤时间温度不匹配，导致杀菌不彻底，另外来自传输带等生产工具、操作人员、包装袋的污染也是主要原因。因此，糕点中污染菌的控制，特别要注意主要人员操作、环境污染以及原料带入污染等[8-9]。
2 糕点中细菌污染溯源
对于糕点中污染菌溯源，有多项技术：①传统的细菌分离以及生化鉴定技术;②多位点序列分型（Multi Locus Sequence Typing，MLST）技术，比较管家基因的区别以分析不同菌株的遗传相关性及差异性，通过对管家基因进行PCR扩増、测序、等位基因对比，得到分离株的ST（Sequence Type，ST）型，以获取菌株之间的亲缘关系实现溯源;③脉冲场凝胶电泳（Pulsed Field Gel Electrophoresis，PFGE）分型技术，将菌体裂解后，选取合适的限制性内切酶对基因组DNA进行酶切，经脉冲场凝胶电泳分离，根据电泳条带的差异性进行分型。近年来，随着新一代基因组测序技术的发展，基于全基因组测序（Whole Genome Sequencing，WGS）的分子分型技术在细菌污染溯源调查中显示出巨大的优势与发展潜力，即采用二代测序技术对细菌进行全基因组测序，统计分析单拷贝直系同源基因，构建系统进化树，溯源结果更清晰明确。可采用多种手段与方法，分析污染源，这更有利于消除污染，排除风险，保证食品安全。目前欧美国家均已开展食品、饮用水中微生物的采集与全基因组测序，通过建立微生物全基因组数据库实现精准溯源，如美国食品药品监督管理局建立了GenomeTrakr、欧盟食品安全专家委员会开展了基因组溯源分析[10]。
3 糕点中细菌污染防治
《食品安全法》规定食品生产经营者是食品安全的第一负责人，当发现生产产品菌落总数不合格时，企业应高度重视，仔细分析不合格原因，对所用到的每一种原辅料进行排查，细化到品种、使用量，排除原辅料导致菌落总数不合格的原因;对加热烘烤或油炸过程，要特别关注加热温度的监测，加热时间的控制，同时还不能忽略粉浆用量，同样的加热温度、加热时间，如果个别产品粉浆用量多，会导致中心温度而不足以杀灭细菌;而对于冷却与包装，更重要的是关注加工环境、加工工具、加工人员等的污染，应加强环境、加工工具与加工人员的卫生控制。冷却包装车间应定期监测浮游菌、沉降菌、悬浮粒子及卫生状况，检测方法可参考《医药工业洁净室（区）浮游菌的测试方法》（GB/T 16293—2010）[11]、《医药工业洁净室（区）沉降菌的测试方法》（GB/T 16294—2010）[12]、《医药工业洁净室（区）悬浮粒子的测试方法》（GB/T 16292—2010）[13];对于加工工具如传输带、包装机，对于工作人员手部、包装材料内表面，应定期进行涂抹实验，监测项目包括菌落总数、大肠菌群、金黄色葡萄球菌等，一旦发现细菌污染或其他异常情况，应立即停止生产排查原因。另外生产车间需做好防蝇、防虫、防鼠等必要的卫生防范措施。运输环节，需有专用的运输设备及工具，有冷藏需要的，还要配备冷链环节，以确保运输途中不受污染[14-15]。 4 结语
菌落总数是判定食品被微生物污染程度的一个重要指标，糕点作为食品中的大类，菌落总数超标的情况较多，也就是说，糕点中微生物污染的情况较为普遍。为了提高糕点质量，解决糕点的食品安全问题，糕点中微生物污染就不能回避。依据《糕点通则》（GB/T 20977—2007）可知，糕点可分为热加工糕点与冷加工糕点。本文从糕点的生产流程入手，分析糕点所使用的主要原料以及各个环节的污染源，并结合全基因组测序及溯源技术，為微生物的污染溯源分析提出了新的解决方法，同时微生物污染源控制如：原辅料采购验收，生产过程工艺控制，加工工具与加工人员的卫生控制，加工环境污染控制，传输带、包装材料与包装机卫生清洁等提出了针对性的污染控制措施。
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[7]王永杰.无包装糕点中菌落总数的生长情况[J].中国卫生产业，2020，17（7）：152-155.
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[9]徐斐，刘莉萍，何定兵.糕点、面包中污染细菌的分离及菌种的初步鉴定[J].工业微生物，2007（2）：45-48.
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[14]崔莹，李艳芬，张秀丽，等.河南省散装糕点微生物污染状况调查及分析[J].中国卫生检验杂志，2014，24（12）：1780-1782.
[15]陈健皓.沙门氏菌快速检测方法的筛选与应用和鸡源、猪源菌株MLST分子溯源及耐药性研究[D].扬州：扬州大学，2017.