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摘 要：为探究甘露子提取物的体外抗氧化活性，本文将甘露子提取物用水提煎煮法、回流醇提法及超声醇提法进行提取，然后采用薄層色谱法对水提物中糖类化合物进行定性检测，黄酮类化合物通过其颜色反应专属性实验进行定性检测，采用DPPH和ABTS自由基清除实验对提取物进行体外抗氧化活性研究。结果表明，甘露子水提物和醇提物都具有体外抗氧化活性，其中超声醇提法提取物的体外抗氧化活性优于回流醇提法、煎煮水提法。由于甘露子具有药食同源性，本研究可为后续食品、保健品领域的开发奠定一定的基础。
关键词：甘露子;提取方法;体外抗氧化活性
甘露子是唇形科植物甘露子的块茎，又叫草石蚕、地蚕、土人参。主要分布于长江附近各省，其具有祛风清热、利水、活血化瘀等功效，用于治疗风热感冒，黄疸等症状，外用可治疗毒蛇咬伤。甘露子的主要化学成分为糖类、黄酮类化合物，有良好的抗肿瘤、抗炎、抗疲劳，提高免疫力等药理作用。
黄酮类化合物具有多种生物活性功能，其中抗氧化作用尤为明显。甘露子中含糖量丰富（鲜品中水苏糖含量在13%左右），水苏糖是一种低聚四糖、稳定、甜度低、热量低，具有促进肠道菌群平衡生理功效[1-2]。由于国内对甘露子提取物的抗氧化活性研究较少，因此本实验通过煎煮水提法提取糖类化合物，回流醇提法、超声醇提法提取黄酮类化合物，糖类化合物通过薄层层析法进行定性检测，黄酮类化合物通过其颜色反应专属性实验进行定性检测。3种提取方法的甘露子提取物通过ABTS和DPPH·清除率实验两种方法进行体外抗氧化活性研究，确定甘露子提取物中水苏糖和黄酮类化合物的体外抗氧化活性。随着生活水平的提高，具有抗氧化活性等保健功效的食品药品备受关注。为此，本文旨在对甘露子提取物的体外抗氧化活性进行研究，以更好地开发利用甘露子[3]。
1 材料与方法
1.1 材料及试剂
鲜甘露子：挑选去除杂质，抢水洗，淋干备用。
无水乙醇、过硫酸钾、磷酸二氢钾、氢氧化钠、维生素C、二苯基-2-三硝基苯肼、2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐、镁粉、浓盐酸、乙醇、三氯化铁、浓硫酸、乙酸乙醋、甲醇、冰醋酸、二苯胺、苯胺、丙酮、85%磷酸、葡萄糖对照品、蔗糖对照品、棉籽糖对照品、水苏糖对照品、均为国产分析纯。
1.2 仪器
2 000 W电炉子（北京光明）、BHS-8220A型干燥箱（上海科技）、TZ-120S6型超声波清洗器（方奥微电子）、ZE-52型旋转蒸发仪（山海雅荣）、DAA428S型电子天平（赛多利斯）、W3新世纪紫外可见分光光度计（北京普析）、PTZ-9C型酸度计（上海科技）、200～1 000 μL型移液器（大龙兴创）。
1.3 实验方法
1.3.1 甘露子提取物的提取
①水提煎煮法。取新鲜甘露子0.5 kg，加4 000 mL水提煎煮3次，每次1 h，合并醇提液，浓缩至每1 g甘露子提取物中含有10 g主药。②回流醇提法。取鲜甘露子0.5 kg，加90%乙醇800 mL回流提取3次，每次1 h，合并提取液，回收溶剂，醇提液浓缩至每1 g甘露子提取物中含有10 g主药。③超声醇提法。取鲜甘露子0.5 kg，加90%乙醇800 mL超声提取3次，每次1 h，回收溶剂，浓缩至每1 g甘露子提取物中含有10 g主药。
1.3.2 甘露子提取物中糖类化合物和黄酮类化合物的定性检测
（1）薄层层析法定性检测甘露子提取物中糖类化合物。①配制对照液。精密称量葡萄糖、蔗糖、棉籽糖、水苏糖对照品，分别加纯化水溶解，配制成浓度为5 mg/mL的对照液。②配制供试液。甘露子提取物分别稀释成5 mg/mL的供试品。③配制显色剂。取5 mLH3PO4、25 mL丙酮、0.5 g
二苯胺、0.5 g苯胺混合摇匀。④点样。各取20 ?L对照液和供试品点在硅胶G板上。⑤展开。以乙酸乙醋-MaOH-水-HAc（3∶2∶1∶2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以显色剂在薄层上，于105 ℃烘箱内加热至斑点显现，取出在日光下检视[4]。
（2）甘露子提取物中黄酮类化合物定性检测。①供试液的制备。3种提取方法下提取液1 mL，分别加10 mL乙醇，摇匀，备用。②HCl-Mg反应。量取供试液0.5 mL，1 mLMeOH，在加0.1 gMg充分进行振摇，加入3滴HCl，摇匀。③络合反应。取供试液0.5 mL，1 mLMeOH，加入1%FeCl32滴，摇匀。④浓H2SO4反应。量取供试液0.5 mL，1 mLMeOH，加浓H2SO4 2滴，摇匀。⑤强碱溶液反应。取供试液0.5 mL，1 mLMeOH，加4%的NaOH溶液1 mL，摇匀[5]。
1.3.3 甘露子提取物体外抗氧化活性实验
供试液配制：精密量取各方法下甘露子提取物，分别加MeOH配制成100 mg/mL的样品溶液，然后稀释成1 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL、30 mg/mL和40 mg/mL的样品溶液。
（1）DPPH自由基清除实验。①配制DPPH反应液。取3.0 mgDPPH，60 mL MeOH，超声5 min溶解，避光放置备用。②空白吸光度测量。取2 mL DPPH反应液于比色皿中，加1 mL MeOH摇匀，在519 nm波长处测量吸收光度值A0。③供试品吸光度测量。取2 mL DPPH反应液于比色皿中，加1 mL供试液摇匀，避光0.5 h，在519 nm波长处测量吸收光度值A，测量3次平行实验。ROS清除率（%）=（A0-A）/A0×100%[6]。
（2）ABTS自由基清除实验。①配制ABTS原液。取
0.012 2 g ABTS，用3 mL纯化水溶解，摇匀。②配制K2S2O8原液。称取0.003 g K2S2O8，加4.3 mL纯化水溶解，摇匀。③配制ABTS反应液。取上述两种原液各3 mL混合均匀，避光反应12 h，用磷酸盐缓冲液（pH7.4）稀释10倍，避光备用。④空白吸光度测量。取2.4 mLABTS反应液加入比色皿中，加0.6 mLMeOH摇匀，在734 nm波长处测量吸收光度值A0。⑤供试品吸光度测量。取2.4 mLABTS反应液加入比色皿中，加0.6 mL供试液摇匀，避光0.5 h，在734 nm波长处测量吸收光度值A，测量3次平行实验。⑥ROS清除率（%）=（A0-A）/A0×100%[7]。 2 结果与分析
2.1 甘露子提取物的提取
实验通过煎煮水提、回流醇提、超声醇提得到甘露子提取物，各提取方法的提取物密度见表1。
2.2 甘露子提取物中糖类化合物和黄酮类化合物的定性检测
本实验通过薄层层析法定性检测甘露子里水提物中是否有糖类化合物，采用理化定性检测甘露子醇提物中是否含有黄酮类化合物。由图1知，煎煮水提法甘露子提取物中糖类化合物的定性检测可知，甘露子的水提取物薄层色谱法呈阳性，从而证实煎煮水提甘露子提取物中含有葡萄糖、蔗糖、棉籽糖、水苏糖。由表2知，通过甘露子提取物中黄酮类化合物定性检测结果，证实了含有黄酮类化合物。
2.3 甘露子提取物体外抗氧化活性实验
本实验通过ABTS和DPPH·清除率两种方法进行甘露子提取物体外抗氧化活性实验，利用VitC进行阳性实验对照，水提物利用水苏糖进行对照实验，验证甘露子水提物、醇提物是否有抗氧化活性，并比较水提物、醇提物清除自由基活性的大小。由图2知，通过经典抗氧化物质VitC阳性对照实验，验证了水提和醇提甘露子提取物体外抗氧化活性的有效性，结果表明，甘露子水提物、醇提物都具有体外清除自由基活性，超声醇提物清除自由基活性优于其他方法提取物清除活性，随着浓度增大清除能力增强。综上所述，甘露子水提物与醇提物都具有体外抗氧化活性。
3 结论
本文首次采用DPPH和ABTS对甘露子水提提取物和醇提提取物进行体外抗氧化活性研究。实验结果证实了水提物和醇提物对自由基都有良好的清除能力。相同浓度甘露子水提物清除自由基的能力低于醇提物清除能力，超声醇提法优于回流醇提法，且濃度的增加清除能力增强。综上所述，甘露子提取物具有良好的体外抗氧化活性，为后续采用秀丽线虫进行体内抗氧化活性研究奠定实验基础，也可将其药理活性开发应用到食品和保健品中。
参考文献
[1]PINTON P，RIZUTO R.Bcl-2 and Ca2+ homeostasis in the endoplas-mic reticulum. Cell[J].Death and Differentiation，2006，13（8）：1409-1418.
[2]CHEN R，VALENCIA I，ZHONG F，et al.Bcl-2 functionally interacts with inositol 4.5-trisphosphate reeptors toregulate calcium release from the ER in respolse to inositol 1，4.5-trisphosphate[J].Journal of Cell Biology，2004，166（2）：193-203.
[3]施树，罗章.甘露子药食功用研究进展[J].农产品加工，2017（10）：62-64.
[4]宋晓凯.天然药物化学[M].3版.北京：化学工业出版社，2016.
[5]姚红，王洪新，朱松，等.草石蚕水苏糖检测技术的研究[J].世界科科技研究与成展，2011，33（2）：284-286.
[6]Li X.Comparative Study of 1，1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyil Radical （DPFH·）Scavenging Capacity of the Antioxidant Xanthones Family[J].Chemistryselect，2018（3）：13081-13086.
[7]LI X，OUYANG X，CAI R，et al.3，8-Dimerization Enhances the Antioxidant Capacity of Flavonoids： Evihce from Acacetin and Isoginkgetin[J].Molecules， 2019，24（11）：2039.
作者简介：刘洪岩（1982—），男，汉族，吉林长春人，本科，助理实验师。研究方向：天然药物成分活性研究，药品质量标准及药品生产工艺研究。
王巍（1982—），女，汉族，吉林舒兰人，硕士，副教授。研究方向：化学制药教学。
刘晓敏（1999—），女，汉族，内蒙古通辽人，本科在读，研究方向：天然药物成分活性研究。
关键词：甘露子;提取方法;体外抗氧化活性
甘露子是唇形科植物甘露子的块茎，又叫草石蚕、地蚕、土人参。主要分布于长江附近各省，其具有祛风清热、利水、活血化瘀等功效，用于治疗风热感冒，黄疸等症状，外用可治疗毒蛇咬伤。甘露子的主要化学成分为糖类、黄酮类化合物，有良好的抗肿瘤、抗炎、抗疲劳，提高免疫力等药理作用。
黄酮类化合物具有多种生物活性功能，其中抗氧化作用尤为明显。甘露子中含糖量丰富（鲜品中水苏糖含量在13%左右），水苏糖是一种低聚四糖、稳定、甜度低、热量低，具有促进肠道菌群平衡生理功效[1-2]。由于国内对甘露子提取物的抗氧化活性研究较少，因此本实验通过煎煮水提法提取糖类化合物，回流醇提法、超声醇提法提取黄酮类化合物，糖类化合物通过薄层层析法进行定性检测，黄酮类化合物通过其颜色反应专属性实验进行定性检测。3种提取方法的甘露子提取物通过ABTS和DPPH·清除率实验两种方法进行体外抗氧化活性研究，确定甘露子提取物中水苏糖和黄酮类化合物的体外抗氧化活性。随着生活水平的提高，具有抗氧化活性等保健功效的食品药品备受关注。为此，本文旨在对甘露子提取物的体外抗氧化活性进行研究，以更好地开发利用甘露子[3]。
1 材料与方法
1.1 材料及试剂
鲜甘露子：挑选去除杂质，抢水洗，淋干备用。
无水乙醇、过硫酸钾、磷酸二氢钾、氢氧化钠、维生素C、二苯基-2-三硝基苯肼、2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐、镁粉、浓盐酸、乙醇、三氯化铁、浓硫酸、乙酸乙醋、甲醇、冰醋酸、二苯胺、苯胺、丙酮、85%磷酸、葡萄糖对照品、蔗糖对照品、棉籽糖对照品、水苏糖对照品、均为国产分析纯。
1.2 仪器
2 000 W电炉子（北京光明）、BHS-8220A型干燥箱（上海科技）、TZ-120S6型超声波清洗器（方奥微电子）、ZE-52型旋转蒸发仪（山海雅荣）、DAA428S型电子天平（赛多利斯）、W3新世纪紫外可见分光光度计（北京普析）、PTZ-9C型酸度计（上海科技）、200～1 000 μL型移液器（大龙兴创）。
1.3 实验方法
1.3.1 甘露子提取物的提取
①水提煎煮法。取新鲜甘露子0.5 kg，加4 000 mL水提煎煮3次，每次1 h，合并醇提液，浓缩至每1 g甘露子提取物中含有10 g主药。②回流醇提法。取鲜甘露子0.5 kg，加90%乙醇800 mL回流提取3次，每次1 h，合并提取液，回收溶剂，醇提液浓缩至每1 g甘露子提取物中含有10 g主药。③超声醇提法。取鲜甘露子0.5 kg，加90%乙醇800 mL超声提取3次，每次1 h，回收溶剂，浓缩至每1 g甘露子提取物中含有10 g主药。
1.3.2 甘露子提取物中糖类化合物和黄酮类化合物的定性检测
（1）薄层层析法定性检测甘露子提取物中糖类化合物。①配制对照液。精密称量葡萄糖、蔗糖、棉籽糖、水苏糖对照品，分别加纯化水溶解，配制成浓度为5 mg/mL的对照液。②配制供试液。甘露子提取物分别稀释成5 mg/mL的供试品。③配制显色剂。取5 mLH3PO4、25 mL丙酮、0.5 g
二苯胺、0.5 g苯胺混合摇匀。④点样。各取20 ?L对照液和供试品点在硅胶G板上。⑤展开。以乙酸乙醋-MaOH-水-HAc（3∶2∶1∶2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以显色剂在薄层上，于105 ℃烘箱内加热至斑点显现，取出在日光下检视[4]。
（2）甘露子提取物中黄酮类化合物定性检测。①供试液的制备。3种提取方法下提取液1 mL，分别加10 mL乙醇，摇匀，备用。②HCl-Mg反应。量取供试液0.5 mL，1 mLMeOH，在加0.1 gMg充分进行振摇，加入3滴HCl，摇匀。③络合反应。取供试液0.5 mL，1 mLMeOH，加入1%FeCl32滴，摇匀。④浓H2SO4反应。量取供试液0.5 mL，1 mLMeOH，加浓H2SO4 2滴，摇匀。⑤强碱溶液反应。取供试液0.5 mL，1 mLMeOH，加4%的NaOH溶液1 mL，摇匀[5]。
1.3.3 甘露子提取物体外抗氧化活性实验
供试液配制：精密量取各方法下甘露子提取物，分别加MeOH配制成100 mg/mL的样品溶液，然后稀释成1 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL、30 mg/mL和40 mg/mL的样品溶液。
（1）DPPH自由基清除实验。①配制DPPH反应液。取3.0 mgDPPH，60 mL MeOH，超声5 min溶解，避光放置备用。②空白吸光度测量。取2 mL DPPH反应液于比色皿中，加1 mL MeOH摇匀，在519 nm波长处测量吸收光度值A0。③供试品吸光度测量。取2 mL DPPH反应液于比色皿中，加1 mL供试液摇匀，避光0.5 h，在519 nm波长处测量吸收光度值A，测量3次平行实验。ROS清除率（%）=（A0-A）/A0×100%[6]。
（2）ABTS自由基清除实验。①配制ABTS原液。取
0.012 2 g ABTS，用3 mL纯化水溶解，摇匀。②配制K2S2O8原液。称取0.003 g K2S2O8，加4.3 mL纯化水溶解，摇匀。③配制ABTS反应液。取上述两种原液各3 mL混合均匀，避光反应12 h，用磷酸盐缓冲液（pH7.4）稀释10倍，避光备用。④空白吸光度测量。取2.4 mLABTS反应液加入比色皿中，加0.6 mLMeOH摇匀，在734 nm波长处测量吸收光度值A0。⑤供试品吸光度测量。取2.4 mLABTS反应液加入比色皿中，加0.6 mL供试液摇匀，避光0.5 h，在734 nm波长处测量吸收光度值A，测量3次平行实验。⑥ROS清除率（%）=（A0-A）/A0×100%[7]。 2 结果与分析
2.1 甘露子提取物的提取
实验通过煎煮水提、回流醇提、超声醇提得到甘露子提取物，各提取方法的提取物密度见表1。
2.2 甘露子提取物中糖类化合物和黄酮类化合物的定性检测
本实验通过薄层层析法定性检测甘露子里水提物中是否有糖类化合物，采用理化定性检测甘露子醇提物中是否含有黄酮类化合物。由图1知，煎煮水提法甘露子提取物中糖类化合物的定性检测可知，甘露子的水提取物薄层色谱法呈阳性，从而证实煎煮水提甘露子提取物中含有葡萄糖、蔗糖、棉籽糖、水苏糖。由表2知，通过甘露子提取物中黄酮类化合物定性检测结果，证实了含有黄酮类化合物。
2.3 甘露子提取物体外抗氧化活性实验
本实验通过ABTS和DPPH·清除率两种方法进行甘露子提取物体外抗氧化活性实验，利用VitC进行阳性实验对照，水提物利用水苏糖进行对照实验，验证甘露子水提物、醇提物是否有抗氧化活性，并比较水提物、醇提物清除自由基活性的大小。由图2知，通过经典抗氧化物质VitC阳性对照实验，验证了水提和醇提甘露子提取物体外抗氧化活性的有效性，结果表明，甘露子水提物、醇提物都具有体外清除自由基活性，超声醇提物清除自由基活性优于其他方法提取物清除活性，随着浓度增大清除能力增强。综上所述，甘露子水提物与醇提物都具有体外抗氧化活性。
3 结论
本文首次采用DPPH和ABTS对甘露子水提提取物和醇提提取物进行体外抗氧化活性研究。实验结果证实了水提物和醇提物对自由基都有良好的清除能力。相同浓度甘露子水提物清除自由基的能力低于醇提物清除能力，超声醇提法优于回流醇提法，且濃度的增加清除能力增强。综上所述，甘露子提取物具有良好的体外抗氧化活性，为后续采用秀丽线虫进行体内抗氧化活性研究奠定实验基础，也可将其药理活性开发应用到食品和保健品中。
参考文献
[1]PINTON P，RIZUTO R.Bcl-2 and Ca2+ homeostasis in the endoplas-mic reticulum. Cell[J].Death and Differentiation，2006，13（8）：1409-1418.
[2]CHEN R，VALENCIA I，ZHONG F，et al.Bcl-2 functionally interacts with inositol 4.5-trisphosphate reeptors toregulate calcium release from the ER in respolse to inositol 1，4.5-trisphosphate[J].Journal of Cell Biology，2004，166（2）：193-203.
[3]施树，罗章.甘露子药食功用研究进展[J].农产品加工，2017（10）：62-64.
[4]宋晓凯.天然药物化学[M].3版.北京：化学工业出版社，2016.
[5]姚红，王洪新，朱松，等.草石蚕水苏糖检测技术的研究[J].世界科科技研究与成展，2011，33（2）：284-286.
[6]Li X.Comparative Study of 1，1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyil Radical （DPFH·）Scavenging Capacity of the Antioxidant Xanthones Family[J].Chemistryselect，2018（3）：13081-13086.
[7]LI X，OUYANG X，CAI R，et al.3，8-Dimerization Enhances the Antioxidant Capacity of Flavonoids： Evihce from Acacetin and Isoginkgetin[J].Molecules， 2019，24（11）：2039.
作者简介：刘洪岩（1982—），男，汉族，吉林长春人，本科，助理实验师。研究方向：天然药物成分活性研究，药品质量标准及药品生产工艺研究。
王巍（1982—），女，汉族，吉林舒兰人，硕士，副教授。研究方向：化学制药教学。
刘晓敏（1999—），女，汉族，内蒙古通辽人，本科在读，研究方向：天然药物成分活性研究。