【摘 要】
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目的 利用CRISPR/Cas9敲除文库在人正常肺上皮细胞致瘤性转化过程中进行全基因组筛选,以发现新的人肺癌抑癌基因,并利用临床非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)样本数据库进行初步验证.方法 构建稳定表达Cas9蛋白的人正常肺上皮BEAS-2B细胞系,在该细胞中感染含有77 441个单链向导RNA(sgRNA)、靶向19 114个人类基因的Brunello慢病毒文库,于裸鼠皮下移植.提取全瘤体细胞(Tumor)及移植前细胞(Input)的全基因组DNA,扩增s
【机 构】
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400038重庆,陆军军医大学(第三军医大学)基础医学院生理学教研室;400038重庆,陆军军医大学(第三军医大学)基础医学院组织学与胚胎学教研室;400038重庆,陆军军医大学(第三军医大学)第一附
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目的 利用CRISPR/Cas9敲除文库在人正常肺上皮细胞致瘤性转化过程中进行全基因组筛选,以发现新的人肺癌抑癌基因,并利用临床非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)样本数据库进行初步验证.方法 构建稳定表达Cas9蛋白的人正常肺上皮BEAS-2B细胞系,在该细胞中感染含有77 441个单链向导RNA(sgRNA)、靶向19 114个人类基因的Brunello慢病毒文库,于裸鼠皮下移植.提取全瘤体细胞(Tumor)及移植前细胞(Input)的全基因组DNA,扩增sgRNA序列,建库进行深度测序.通过分析Tumor中sgRNA读数占比及Tumor与Input中sgRNA读数差异倍数的改变,筛选功能缺失后诱导BEAS-2B细胞致瘤性转化的抑癌基因,并利用公共数据平台进行初步验证.结果 成功在稳定表达Cas9蛋白的BEAS-2B细胞中进行了文库感染及裸鼠皮下成瘤实验.只有感染文库的细胞在部分接种位点成瘤.测序结果显示Tumor中只检测到少数sgRNA,选取sgRNA的读数占总读数的比例＞1％或有2个及以上sgRNA被显著富集的38个基因为有效的人肺癌候选抑癌基因,包括NF2、PTEN等已知抑癌基因及未在肺癌中报道过的候选抑癌基因,如AP2M1、PSENEN等.富集分析发现候选抑癌基因在Notch和Hippo信号等参与癌症发生的关键生物学通路中富集.应用临床NSCLC样本数据库证实38个候选抑癌基因在NSCLC样本中均发生了突变,其中突变率＞2％的17个基因中有14个与KRAS或TP53发生共突变,3个突变与预后相关;30个基因在NSCLC样本中的表达水平与正常癌旁组织有明显差异,17个基因的表达水平与患者的预后密切相关.结论 利用体内全基因组CRISPR/Cas9技术筛选出38个人肺癌候选抑癌基因,并在临床NSCLC样本数据库中得到了初步验证.
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