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[摘要] 目的 探讨莪术醇β-环糊精包合物作用对肝癌细胞的增殖与凋亡及细胞周期的影响及其分子机制。 方法 采用不同浓度莪术醇β-环糊精包合物处理肝癌Bel-7404细胞后，噻唑蓝[3-（4，5）-dimethylthiahiazo （-z-y1）-3，5-di-phenytetrazoliumromide， MTT]比色法测定细胞增殖，流式细胞仪检测细胞周期与凋亡情况。Western blot检测细胞周期调控相关基因的表达水平。 结果 MTT法检测结果显示，与对照组比较，莪术醇β-环糊精包合物各剂量组生长抑制率均明显升高，呈剂量与时间依赖性，差异有统计学意义（P<0.05）。流式细胞术检测结果显示，莪术醇β-环糊精包合物处理促进细胞凋亡（P<0.05），并使细胞阻滞在G0/G1期（P<0.05），伴随p21WAF1及p27KIP1的表达水平升高。 结论 莪术醇β-环糊精包合物能够抑制肝癌细胞Bel-7404的增殖，促进凋亡，并通过上调p21WAF1及p27KIP1基因的表达而诱导G1期阻滞。
[关键词] 肝癌；莪术醇；β-环糊精；细胞周期阻滞
[中图分类号] R285 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2015）16-0011-04
[Abstract] Objective To investigate the effects and mechanisms of curcumol-β-cyclodextrin inclusion compound on the proliferation， apoptosis， and cell cycle of human hepatocarcinoma cell line Bel-7404. Methods The effects of different dose of curcumol-β-cyclodextrin inclusion compound on proliferation of human hepatocarcinoma cell line Bel-7404 in vitro was analyzed by MTT assay（P<0.05）. The cell cycles and apoptosis were detected by flow cytometer（P<0.05）. Expression of cycle regulation-related genes were assessed by Western blot. Results Compared with control groups， MTT results showed that curcumol-β-cyclodextrin inclusion compound significantly inhibited the proliferation of Bel-7404 cells in a dose- and time-dependent manner. The results of flow cytometry showed that curcumol-β-cyclodextrin inclusion compound resulted in the cell cycle arrest at G0/G1 phase and increased the apoptotic cell fraction（P<0.05）. Western blotting results showed that curcumol-β-cyclodextrin inclusion compound increased the expression of p21WAF1 and p27KIP1. Conclusion Curcumol-β-cyclodextrin inclusion compound inhibits the growth and induces apoptosis and G0/G1 phase arrest of Bel-7404 in vitro. The mechanisms of G1 arrest may be related to the regulation of the p21WAF1 and p27KIP1.
[Key words] Hepatocarcinoma； Curcumol； β-cyclodextrin； Cell cycle arrest
原发性肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，一旦确诊多数患者已为晚期，丧失手术治疗的最佳时机[1]。尽管肝癌的综合治疗措施不断发展完善，但目前肝癌患者的预后极差。因此，开发治疗效果好、毒副作用小的抗肿瘤治疗药物，从而进一步提高肝癌的治疗效果，是临床和基础研究的重点。已有的大量研究表明，中医药在肿瘤治疗方面有着独特、高效、低毒的优势[2]。莪术醇，又名姜黄环奥醇，是从传统中药莪术挥发油中提取出来的倍半萜类化合物。已有研究发现，莪术醇能够以剂量依赖的方式抑制肝癌、卵巢癌等恶性肿瘤细胞的增殖，表明莪术醇具有开发应用的前景[3]。但莪术醇水溶性不佳，限制了其在临床与基础研究里的应用价值。如何提高其水溶性是当前研究的热点。β-环糊精是一种常用的药物辅料，具有良好的水溶性和增溶效果，其安全性已被广泛认可[4]。β-环糊精的作用机制是通过将水溶性差的分子包入其疏水性空腔中，进而形成水溶性包合物，以提高药物的溶解性能，增加药物的生物利用度。我们之前的研究中制备的莪术醇与β-环糊精的包合物，较莪术醇的溶解度提高了10.3倍。有关体外抗肿瘤活性研究发现，莪术醇β-环糊精包合物可明显抑制食管癌细胞增殖并诱导凋亡[5]。本研究在此基础上，于2014年6～12月进一步观察莪术醇β-环糊精包合物对人肝癌Bel-7404细胞的抑制效果，并探讨其对细胞周期及其细胞周期调控基因表达的影响。 1 材料与方法
1.1 试剂来源
莪术醇（中国药品生物制品检定所）；MTT（美国Invitrogen公司）；β-环糊精（天津市光复精细化工研究所）；DMEM培养基（美国Gibco公司）；兔抗人p21单克隆抗体（美国CST公司）；兔抗人p27单克隆抗体（美国CST公司）；胎牛血清（美国Gibco公司）；Annexin V-FITC-PI双染细胞凋亡检测试剂盒（南京凯基生物科技发展公司）。
1.2 细胞培养
Bel-7404人肝癌细胞株购于美国ATCC细胞库，细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基，在37℃、5%CO2条件下传代培养。取对数生长期状态良好的细胞进行以下实验。
1.3 检测指标及方法
1.3.1 MTT法测定肝癌细胞增殖情况 取对数生长期的细胞以104个细胞/孔的密度接种于96孔培养板中。培养24 h后，分别加入终浓度为25、50、100 mg/L莪术醇β-环糊精包合物培养液100 μL，每组设置3个复孔。分别培养48 h与72 h后，每孔分别加入MTT溶液50 μL（5 g/L），37℃继续培养4 h后结束培养。然后，每孔加入150 μL DMSO，放于摇床振荡10 min，在酶标仪在570 nm处测定每孔的吸光值（A）。实验重复3次取平均值，并计算相应的生长抑制率。公式：生长抑制率（%）=（1-药物组A值/对照组A值）×100%。
1.3.2 细胞凋亡检测 根据细胞凋亡检测试剂盒说明，经莪术醇β-环糊精包合物处理48 h 后，胰酶消化，收集各组细胞。用PBS洗涤细胞2次，分别加入1×Binding Buffer 500 μL悬浮细胞，然后各加入5 μL PI与5 μL Annexin V-FITC充分混匀后，室温、静置15 min，流式细胞仪上检测。
1.3.3 细胞周期检测 Bel-7404细胞经25、50、100 mg/L莪术醇β-环糊精包合物处理48 h后，分别收集细胞，PBS洗涤细胞2次，于4℃、70%乙醇固定24 h。PBS洗3次后，加入Tris-HCl缓冲液，37℃避光孵育30 min，加入50 μg/mL的PI进行细胞DNA染色。采用流式细胞仪检测细胞周期，分别计算处于各期的细胞所占比例。
1.3.4 Western blot法检测细胞周期蛋白的表达 Bel-7404细胞经不同浓度莪术醇β-环糊精包合物处理48 h后，收集细胞，提取细胞总蛋白。取煮沸后的蛋白样品50 μg，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后转移至硝酸纤维素膜。室温封闭2 h，分别加入兔抗人p21与p27单克隆抗体（1∶1000）4℃过夜。充分洗涤后，加入1∶3000稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗，37℃孵育2 h。采用增强化学发光法显色检测特异条带，并以GAPDH作为内参对照。
1.4 统计学分析
采用SPSS19.0统计学软件进行分析，计量资料以（x±s）表示。多样本均数比较采用单因素方差分析，样本间两两比较采用SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 莪术醇β-环糊精包合物处理对细胞增殖能力的影响
经不同浓度莪术醇β-环糊精包合物处理Bel-7404细胞48 h与72 h后，细胞增殖能力下降，见图1。25、50、100 mg/L浓度的莪术醇β-环糊精包合物处理48 h后，Bel-7404细胞的抑制率分别为（14.41±1.32）%，（27.38±1.05）%与（34.75±1.49）%，随着药物浓度的增加，细胞增殖明显受到抑制，有明显的剂量依赖性（F=38.75，P<0.05）。各浓度作用72 h后，Bel-7404细胞的抑制率分别为（18.99±1.62）%，（34.89±2.38）%与（44.24±1.83）%，有明显的剂量依赖性（F=64.99，P<0.01），提示莪术醇β-环糊精包合物能够以时间与剂量依赖的方式抑制肝癌细胞Bel-7404的增殖。
2.2 莪术醇β-环糊精包合物对细胞凋亡的影响
通过不同浓度莪术醇β-环糊精包合物处理48 h后，25、50、100 mg/L浓度组细胞经流式细胞仪检测可见凋亡率分别为（4.29±0.77）%，（9.41±1.56）%，（16.38±1.05）%，（23.75±1.98）%，莪术醇β-环糊精包合物作用后肝癌细胞的凋亡率明显增加，并且随莪术醇β-环糊精包合物的剂量增加而增加（F=74.37，P<0.01）。提示莪术醇β-环糊精包合物能够以剂量依赖的方式诱导肝癌细胞凋亡。
2.3 莪术醇β-环糊精包合物处理对细胞周期的影响
采用不同浓度莪术醇β-环糊精包合物处理48 h后，Bel-7404细胞周期分布出现明显变化，见表1。不同浓度莪术醇β-环糊精包合物处理后可引起G2/M期（F=18.68，P<0.05）与S期的细胞比例逐渐减少（F=18.12，P<0.05），而G0/G1期的细胞比例逐渐增加（F=88.01，P<0.01）。提示莪术醇β-环糊精包合物可导致Bel-7404细胞出现G0/G1期细胞阻滞，且在（25～100）mg/L浓度范围内随着莪术醇β-环糊精包合物浓度增加，其阻滞作用增强。
2.4 莪术醇β-环糊精包合物处理对细胞周期调控基因表达的影响
采用Western blot检测莪术醇处理48 h后Bel-7404细胞中p21WAF1与p27KIP1蛋白水平。结果显示，经莪术醇β-环糊精包合处理，细胞的p21WAF1与p27KIP1蛋白的表达水平较对照组明显升高，见图2。提示细胞周期负性调控因子p21WAF1与p27KIP1参与了莪术醇β-环糊精包合物所诱导的细胞周期阻滞。
3 讨论 莪术醇是从中药莪术中分离得到的单体化合物，具有高效低毒的特点，作为传统的抗肿瘤药物，近年来被试用于治疗肿瘤并取得一定成效[6，7]。但由于其水溶性极低，限制了开发与应用。为增加莪术醇的水溶性，研究人员进行了多种尝试。β-环糊精是一种安全有效的药物增溶剂，能够增加药物的溶解度和利用度。我们已经发现，莪术醇β-环糊精包合物水溶性增加，并具有体外抗食管癌作用。
在此基础上，我们研究了莪术醇β-环糊精合成的包合物的体外抗肝癌细胞活性。研究结果表明，包合物可显著抑制肝癌细胞的增殖，并诱导细胞凋亡。进一步的细胞周期分析发现，莪术醇β-环糊精包和物有诱导明显的G0/G1期阻滞，提示莪术醇β-环糊精包和物抗肝癌机制，可能与诱导凋亡与细胞周期阻滞有关。
增殖与凋亡的异常是恶性肿瘤的显著特征，抑制肿瘤细胞增殖并诱导凋亡是目前肿瘤药物研发的关键，也是评估抗肿瘤药物效果的重要指标[8，9]。大量的体外研究已证实，诱导肿瘤细胞凋亡是莪术醇发挥抗肿瘤作用的重要机制[10，11]。莪术醇β-环糊精包和物可明显抑制肝癌细胞的增殖并诱导凋亡，提示其可能成为抗肝癌治疗的候选药物。
细胞周期正常运行受到细胞周期蛋白（cyclin）、周期蛋白依赖性激酶（CDK）和CDK抑制物（CDKI）等多种调控因子的调节。真核细胞内主要存在3个检查点（check point）：G1/S 期、G2/M期及纺锤体装配检查点，检查点的异常导致细胞周期紊乱，细胞增殖失控，发生癌变[12，13]。CDK是细胞周期检查点的效应器，推动细胞通过检查点。CDK的活性受到cyclin的调控[14，15]。CDK在细胞周期特定的时间与特异的cyclin结合，形成cyclin-CDK复合物，并磷酸化细胞中多种蛋白质底物，从而推动细胞周期向下一阶段的运行。p21WAF1和p27KIP1均为CDKI家族在G1期的重要负调控因子，对多种G1和S期的cyclin-CDK复合物均有抑制作用，使细胞周期阻滞于G1期[16]。本研究采用Western blot检测发现，莪术醇β-环糊精包和物能够显著升高p21WAF1和p27KIP1的表达，从而引起G1期阻滞。
综上所述，莪术醇β-环糊精包合物能够抑制肝癌细胞Bel-7404的增殖，其机制可能是通过诱导细胞凋亡，通过上调p21WAF1及p27KIP1的表达，引起 G1期阻滞来实现的。
[参考文献]
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（收稿日期：2015-02-02）
[关键词] 肝癌；莪术醇；β-环糊精；细胞周期阻滞
[中图分类号] R285 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2015）16-0011-04
[Abstract] Objective To investigate the effects and mechanisms of curcumol-β-cyclodextrin inclusion compound on the proliferation， apoptosis， and cell cycle of human hepatocarcinoma cell line Bel-7404. Methods The effects of different dose of curcumol-β-cyclodextrin inclusion compound on proliferation of human hepatocarcinoma cell line Bel-7404 in vitro was analyzed by MTT assay（P<0.05）. The cell cycles and apoptosis were detected by flow cytometer（P<0.05）. Expression of cycle regulation-related genes were assessed by Western blot. Results Compared with control groups， MTT results showed that curcumol-β-cyclodextrin inclusion compound significantly inhibited the proliferation of Bel-7404 cells in a dose- and time-dependent manner. The results of flow cytometry showed that curcumol-β-cyclodextrin inclusion compound resulted in the cell cycle arrest at G0/G1 phase and increased the apoptotic cell fraction（P<0.05）. Western blotting results showed that curcumol-β-cyclodextrin inclusion compound increased the expression of p21WAF1 and p27KIP1. Conclusion Curcumol-β-cyclodextrin inclusion compound inhibits the growth and induces apoptosis and G0/G1 phase arrest of Bel-7404 in vitro. The mechanisms of G1 arrest may be related to the regulation of the p21WAF1 and p27KIP1.
[Key words] Hepatocarcinoma； Curcumol； β-cyclodextrin； Cell cycle arrest
原发性肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，一旦确诊多数患者已为晚期，丧失手术治疗的最佳时机[1]。尽管肝癌的综合治疗措施不断发展完善，但目前肝癌患者的预后极差。因此，开发治疗效果好、毒副作用小的抗肿瘤治疗药物，从而进一步提高肝癌的治疗效果，是临床和基础研究的重点。已有的大量研究表明，中医药在肿瘤治疗方面有着独特、高效、低毒的优势[2]。莪术醇，又名姜黄环奥醇，是从传统中药莪术挥发油中提取出来的倍半萜类化合物。已有研究发现，莪术醇能够以剂量依赖的方式抑制肝癌、卵巢癌等恶性肿瘤细胞的增殖，表明莪术醇具有开发应用的前景[3]。但莪术醇水溶性不佳，限制了其在临床与基础研究里的应用价值。如何提高其水溶性是当前研究的热点。β-环糊精是一种常用的药物辅料，具有良好的水溶性和增溶效果，其安全性已被广泛认可[4]。β-环糊精的作用机制是通过将水溶性差的分子包入其疏水性空腔中，进而形成水溶性包合物，以提高药物的溶解性能，增加药物的生物利用度。我们之前的研究中制备的莪术醇与β-环糊精的包合物，较莪术醇的溶解度提高了10.3倍。有关体外抗肿瘤活性研究发现，莪术醇β-环糊精包合物可明显抑制食管癌细胞增殖并诱导凋亡[5]。本研究在此基础上，于2014年6～12月进一步观察莪术醇β-环糊精包合物对人肝癌Bel-7404细胞的抑制效果，并探讨其对细胞周期及其细胞周期调控基因表达的影响。 1 材料与方法
1.1 试剂来源
莪术醇（中国药品生物制品检定所）；MTT（美国Invitrogen公司）；β-环糊精（天津市光复精细化工研究所）；DMEM培养基（美国Gibco公司）；兔抗人p21单克隆抗体（美国CST公司）；兔抗人p27单克隆抗体（美国CST公司）；胎牛血清（美国Gibco公司）；Annexin V-FITC-PI双染细胞凋亡检测试剂盒（南京凯基生物科技发展公司）。
1.2 细胞培养
Bel-7404人肝癌细胞株购于美国ATCC细胞库，细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基，在37℃、5%CO2条件下传代培养。取对数生长期状态良好的细胞进行以下实验。
1.3 检测指标及方法
1.3.1 MTT法测定肝癌细胞增殖情况 取对数生长期的细胞以104个细胞/孔的密度接种于96孔培养板中。培养24 h后，分别加入终浓度为25、50、100 mg/L莪术醇β-环糊精包合物培养液100 μL，每组设置3个复孔。分别培养48 h与72 h后，每孔分别加入MTT溶液50 μL（5 g/L），37℃继续培养4 h后结束培养。然后，每孔加入150 μL DMSO，放于摇床振荡10 min，在酶标仪在570 nm处测定每孔的吸光值（A）。实验重复3次取平均值，并计算相应的生长抑制率。公式：生长抑制率（%）=（1-药物组A值/对照组A值）×100%。
1.3.2 细胞凋亡检测 根据细胞凋亡检测试剂盒说明，经莪术醇β-环糊精包合物处理48 h 后，胰酶消化，收集各组细胞。用PBS洗涤细胞2次，分别加入1×Binding Buffer 500 μL悬浮细胞，然后各加入5 μL PI与5 μL Annexin V-FITC充分混匀后，室温、静置15 min，流式细胞仪上检测。
1.3.3 细胞周期检测 Bel-7404细胞经25、50、100 mg/L莪术醇β-环糊精包合物处理48 h后，分别收集细胞，PBS洗涤细胞2次，于4℃、70%乙醇固定24 h。PBS洗3次后，加入Tris-HCl缓冲液，37℃避光孵育30 min，加入50 μg/mL的PI进行细胞DNA染色。采用流式细胞仪检测细胞周期，分别计算处于各期的细胞所占比例。
1.3.4 Western blot法检测细胞周期蛋白的表达 Bel-7404细胞经不同浓度莪术醇β-环糊精包合物处理48 h后，收集细胞，提取细胞总蛋白。取煮沸后的蛋白样品50 μg，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后转移至硝酸纤维素膜。室温封闭2 h，分别加入兔抗人p21与p27单克隆抗体（1∶1000）4℃过夜。充分洗涤后，加入1∶3000稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗，37℃孵育2 h。采用增强化学发光法显色检测特异条带，并以GAPDH作为内参对照。
1.4 统计学分析
采用SPSS19.0统计学软件进行分析，计量资料以（x±s）表示。多样本均数比较采用单因素方差分析，样本间两两比较采用SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 莪术醇β-环糊精包合物处理对细胞增殖能力的影响
经不同浓度莪术醇β-环糊精包合物处理Bel-7404细胞48 h与72 h后，细胞增殖能力下降，见图1。25、50、100 mg/L浓度的莪术醇β-环糊精包合物处理48 h后，Bel-7404细胞的抑制率分别为（14.41±1.32）%，（27.38±1.05）%与（34.75±1.49）%，随着药物浓度的增加，细胞增殖明显受到抑制，有明显的剂量依赖性（F=38.75，P<0.05）。各浓度作用72 h后，Bel-7404细胞的抑制率分别为（18.99±1.62）%，（34.89±2.38）%与（44.24±1.83）%，有明显的剂量依赖性（F=64.99，P<0.01），提示莪术醇β-环糊精包合物能够以时间与剂量依赖的方式抑制肝癌细胞Bel-7404的增殖。
2.2 莪术醇β-环糊精包合物对细胞凋亡的影响
通过不同浓度莪术醇β-环糊精包合物处理48 h后，25、50、100 mg/L浓度组细胞经流式细胞仪检测可见凋亡率分别为（4.29±0.77）%，（9.41±1.56）%，（16.38±1.05）%，（23.75±1.98）%，莪术醇β-环糊精包合物作用后肝癌细胞的凋亡率明显增加，并且随莪术醇β-环糊精包合物的剂量增加而增加（F=74.37，P<0.01）。提示莪术醇β-环糊精包合物能够以剂量依赖的方式诱导肝癌细胞凋亡。
2.3 莪术醇β-环糊精包合物处理对细胞周期的影响
采用不同浓度莪术醇β-环糊精包合物处理48 h后，Bel-7404细胞周期分布出现明显变化，见表1。不同浓度莪术醇β-环糊精包合物处理后可引起G2/M期（F=18.68，P<0.05）与S期的细胞比例逐渐减少（F=18.12，P<0.05），而G0/G1期的细胞比例逐渐增加（F=88.01，P<0.01）。提示莪术醇β-环糊精包合物可导致Bel-7404细胞出现G0/G1期细胞阻滞，且在（25～100）mg/L浓度范围内随着莪术醇β-环糊精包合物浓度增加，其阻滞作用增强。
2.4 莪术醇β-环糊精包合物处理对细胞周期调控基因表达的影响
采用Western blot检测莪术醇处理48 h后Bel-7404细胞中p21WAF1与p27KIP1蛋白水平。结果显示，经莪术醇β-环糊精包合处理，细胞的p21WAF1与p27KIP1蛋白的表达水平较对照组明显升高，见图2。提示细胞周期负性调控因子p21WAF1与p27KIP1参与了莪术醇β-环糊精包合物所诱导的细胞周期阻滞。
3 讨论 莪术醇是从中药莪术中分离得到的单体化合物，具有高效低毒的特点，作为传统的抗肿瘤药物，近年来被试用于治疗肿瘤并取得一定成效[6，7]。但由于其水溶性极低，限制了开发与应用。为增加莪术醇的水溶性，研究人员进行了多种尝试。β-环糊精是一种安全有效的药物增溶剂，能够增加药物的溶解度和利用度。我们已经发现，莪术醇β-环糊精包合物水溶性增加，并具有体外抗食管癌作用。
在此基础上，我们研究了莪术醇β-环糊精合成的包合物的体外抗肝癌细胞活性。研究结果表明，包合物可显著抑制肝癌细胞的增殖，并诱导细胞凋亡。进一步的细胞周期分析发现，莪术醇β-环糊精包和物有诱导明显的G0/G1期阻滞，提示莪术醇β-环糊精包和物抗肝癌机制，可能与诱导凋亡与细胞周期阻滞有关。
增殖与凋亡的异常是恶性肿瘤的显著特征，抑制肿瘤细胞增殖并诱导凋亡是目前肿瘤药物研发的关键，也是评估抗肿瘤药物效果的重要指标[8，9]。大量的体外研究已证实，诱导肿瘤细胞凋亡是莪术醇发挥抗肿瘤作用的重要机制[10，11]。莪术醇β-环糊精包和物可明显抑制肝癌细胞的增殖并诱导凋亡，提示其可能成为抗肝癌治疗的候选药物。
细胞周期正常运行受到细胞周期蛋白（cyclin）、周期蛋白依赖性激酶（CDK）和CDK抑制物（CDKI）等多种调控因子的调节。真核细胞内主要存在3个检查点（check point）：G1/S 期、G2/M期及纺锤体装配检查点，检查点的异常导致细胞周期紊乱，细胞增殖失控，发生癌变[12，13]。CDK是细胞周期检查点的效应器，推动细胞通过检查点。CDK的活性受到cyclin的调控[14，15]。CDK在细胞周期特定的时间与特异的cyclin结合，形成cyclin-CDK复合物，并磷酸化细胞中多种蛋白质底物，从而推动细胞周期向下一阶段的运行。p21WAF1和p27KIP1均为CDKI家族在G1期的重要负调控因子，对多种G1和S期的cyclin-CDK复合物均有抑制作用，使细胞周期阻滞于G1期[16]。本研究采用Western blot检测发现，莪术醇β-环糊精包和物能够显著升高p21WAF1和p27KIP1的表达，从而引起G1期阻滞。
综上所述，莪术醇β-环糊精包合物能够抑制肝癌细胞Bel-7404的增殖，其机制可能是通过诱导细胞凋亡，通过上调p21WAF1及p27KIP1的表达，引起 G1期阻滞来实现的。
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（收稿日期：2015-02-02）