【摘 要】
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旨在构建编码山羊CREBZF蛋白2种亚型(长亚型SM ILE和短亚型Zhangfei)基因的过表达载体,并初步探究CREBZF对山羊子宫内膜上皮细胞(gEECs)凋亡的影响.本研究针对编码山羊CREBZF不同亚型的基因CDS区分别设计引物,分段进行PCR扩增;运用无缝克隆技术将所获得各目的 基因片段与线性化pcDNA3.1(+)载体连接,构建pcDNA3.1(+)-SMILE和pcDNA3.1 (-+)-Zhangfei重组过表达载体,通过双酶切和测序进行鉴定;转染过表达载体至gEECs,提取总RNA和蛋
【机 构】
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西北农林科技大学动物医学院,杨凌712100
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旨在构建编码山羊CREBZF蛋白2种亚型(长亚型SM ILE和短亚型Zhangfei)基因的过表达载体,并初步探究CREBZF对山羊子宫内膜上皮细胞(gEECs)凋亡的影响.本研究针对编码山羊CREBZF不同亚型的基因CDS区分别设计引物,分段进行PCR扩增;运用无缝克隆技术将所获得各目的 基因片段与线性化pcDNA3.1(+)载体连接,构建pcDNA3.1(+)-SMILE和pcDNA3.1 (-+)-Zhangfei重组过表达载体,通过双酶切和测序进行鉴定;转染过表达载体至gEECs,提取总RNA和蛋白,通过qRT-PCR和Western blot验证过表达效率;应用流式细胞术检测过表达SMILE和Zhangfei对gEECs凋亡率的影响.PCR、双酶切显示各目的 条带大小正确;测序显示目的 片段与NCBI基因库中山羊CREBZF的预测序列一致性为100％;转染过表达载体后,gEECs中SMILE与Zhangfei在转录和翻译水平的表达量均显著增加,并发现SMILE可能在翻译后自身被修饰;空载体组细胞凋亡率为8.45％;转染pcDNA3.1 (+)-SMILE组凋亡率显著上升至12.41％(P＜0.01);转染pcDNA3.1 (+-)-Zhangfe组凋亡率上升至9.83％,但相较于空载体组统计学差异不显著;结果提示,CREBZF可能调控gEECs的凋亡进程.本研究将目的 基因分段克隆与无缝克隆技术联用,构建了上述2种过表达载体,为进一步探究C REBZF在反刍动物子宫内膜上皮细胞周期性变化中的作用奠定基础.
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