食管癌是常见恶性肿瘤之一,严重危害人类的健康和生命。目前食管癌的发病率位于世界恶性肿瘤的第六位,位于中国恶性肿瘤的第四位。在河南省林州市,食管癌的发病率和死亡率位居首位。食管癌手术后易复发,5年生存率低。所以,为寻找食管癌新的有效的治疗方法,siRNA干扰成为最近几年基因治疗研究的热点。　　 Hedgehog(Hh)信号通路是一个高度保守的信号通路,它不仅在人类胚胎发育、器官形成和组织分化中发挥着重要的,而且在组织修复中也发挥着重要的作用。已证实食管癌、肺小细胞癌、基底细胞癌、膀胱癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、胃癌、结肠癌、卵巢癌、肝细胞癌等肿瘤的发生发展与Hh信号通路的异常激活有关。Smoothened(Smo)蛋白是Hh信号通路的膜蛋白,Smo基因过表达在胃癌、基底细胞癌、结肠癌等肿瘤的发生发展中发挥着重要作用。　　 Smo基因异常表达与食管癌关系的研究未曾见报道,本课题组成员已从组织学层面对Smo基因与食管鳞癌关系,研究结果表明:Smo蛋白和Smo mRNA及其下游转录因子Glil蛋白和Glil mRNA在食管鳞癌组织中均高表达,并均显著高于癌旁组织和正常食管黏膜组织,均与食管鳞癌发生、浸润、转移有关;Smo与Glil表达呈正相关关系,表明Smo异常表达可通过调节Glil表达促进食管癌的发生发展。　　 本课题从食管癌细胞系进一步验证Smo基因与食管癌细胞的关系。运用Smo siRNA转染食管癌EC9706细胞,采用Western blot和细胞免疫组化检测各组食管癌EC9706细胞中Smo及其下游转录因子Glil蛋白表达水平;采用半定量RT-PCR和原位杂交检测各组食管癌EC9706细胞中Smo和Glil mRNA表达水平;采用MTT法检测各组细胞增殖情况:运用流式细胞仪和TUNEL法检测各组细胞凋亡情况。目的:探讨在Smo基因位点上阻断Hh信号通路的可能性,并为抑制食管癌细胞增殖、诱导其凋亡奠定理论基础。　　 材料和方法：　　 1.人食管鳞癌EC9706细胞在5％CO2、温度为37℃的培养箱中培养,在LipofectamineTM2000介导Smo siRNA转染EC9706细胞。　　 2.运用免疫细胞化学法和Western Blot技术检测各组细胞中Smo和Glil蛋白的表达。　　 3.采用细胞原位杂交技术和RT-PCR技术检测各组细胞中Smo和GlilmRNA的表达。　　 4.采用MIT法检测各组细胞生长抑制率。　　 5.运用流式细胞仪和TUNEL检测各组细胞凋亡变化情况。　　 6.统计学处理:使用SPSS17.0进行统计分析,检验水准α=0.05。　　 结果　　 1.筛选Smo siRNA转染浓度:使用33nM、66nM、99nM三个浓度的FAM-siRNA转染人的食管癌EC9706细胞,转染24h后,在荧光显微镜下观察,99nM浓度组的转染效率最高,后续实验均采用此浓度。　　 2.筛选Smo siRNA特异性最佳片段:细胞对照组、无关序列组和转染试剂组都对食管癌EC9706细胞Smo和Glil mRNA表达无影响,且两两之间差异无统计学意义(P＞0.05)。三条化学合成的Smo siRNA(Smo siRNA-1、Smo siRNA-2、Smo siRNA-3)转染食管癌EC9706细胞,Smo和Glil mRNA表达水平都明显低于各对照(P＜0.05),Smo siRNA-3转染组Smo和Glil mRNA表达水平最低(P＜0.05),后续实验使用Smo siRNA-3序列。　　 3.Smo siRNA对Smo和Glil蛋白表达的影响:Smo siRNA-3可抑制Smo和Glil蛋白表达,以转染72h较显著(P＜0.05),且具有时间依赖性(P＜0.05);与细胞对照组、转染试剂组和无关序列组相比,差异具有统计学意义。　　 4.Smo siRNA-3对Smo和Glil mRNA表达水平的影响:Smo siRNA-3转染EC9706细胞可抑制Smo和Glil mRNA的表达,以转染72h较显著(P＜0.05),且具有时间依赖性(P＜0.05);与细胞对照组、转染试剂组和无关序列组相比,差异具有统计学意义。　　 5.Smo siRNA-3对食管癌EC9706细胞增殖的影响:与各对照组相比,SmosiRNA-3可抑制细胞生长,且具有时间依赖性(P＜0.05)。　　 6.Smo siRNA对食管癌EC9706细胞凋亡的影响:Smo siRNA-3转染食管癌EC9706细胞48h、72h,与各对照组相比,Smo siRNA-3组促进细胞凋亡,差异均有统计学意义(P＜0.05)。　　 结论　　 1.Smo siRNA抑制人食管癌EC9706细胞中Smo基因表达,下调其下游转录因子Glil蛋白及其mRNA的表达。　　 2.Smo siRNA抑制人食管癌EC9706细胞增殖,诱导其凋亡。