脑胶质瘤起源自神经系统胶质细胞和神经元细胞,是颅内最常见的恶性肿瘤,占所有恶性脑肿瘤的80%,而且半数以上为高度恶性的多形性胶质母细胞瘤（Glioblastoma Multiforme,GBM）。尽管随着肿瘤基因、免疫与微环境研究的深入和新技术的发展,丰富了胶质瘤发生、发展机制,使得临床诊断更加准确,病理分型更加规范,临床预后评估更加精准。但由于胶质瘤高度异质性、侵袭性和脑功能的特殊性等众多因素,使之难以全切,易复发,胶质瘤的标准治疗仍是手术和放化疗。胶质瘤恶性程度随着其生长年限延长和复发次数的增加,呈现不断增加的趋势。目前脑胶质瘤临床疗效仍不理想,特别是GBM。替莫唑胺（Temozolomide,TMZ）是GBM治疗最常用药物,仅将生存期延长2-5个月,且疗效因人而异。TMZ的耐药性是GBM化疗失败的主要原因,增强TMZ化疗敏感性和开发新的药物是目前胶质瘤研究的热点之一。胶质瘤细胞像其他癌细胞一样,暴露在各种各样的内外环境的应激,包括:癌基因激活、染色体数目的改变、基因组不稳定性、突变率增加、氧化应激、营养缺乏、酸中毒和钙稳态失调等。这些应激导致内质网（edoplasmic reticulum,ER）中未（或错误）折叠蛋白的积累,如超出ER折叠能力,将导致内质网应激（edoplasmic reticulum stress,ERS）。为了应对ERS,细胞激活自适应性反应,增强对未（或错误）折叠蛋白的修复,使之在恶劣条件下生存而不是发生细胞凋亡,此反应过程称之为未折叠蛋白反应（unfolded protein response,UPR）。ERS过强或持续时间过长,UPR介导细胞凋亡。调控UPR已被视为胶质瘤治疗的新的方向之一。KDELR是一种七次跨膜蛋白,包含3个成员组成,即KDEL1、KDELR2、KDELR3。KDELR介导从高尔基到内质网的蛋白质循环,可以有效维持内质网管腔蛋白的驻留,可防止肽链发生错误折叠和错误装配。目前研究证实,KDELR可通过多种途径参与ERS,包括:（1）通过其检索能力;（2）诱导p38磷酸化,调控p38MAPK信号通路;（3）激活PKA和Src激酶,调节内质网和高尔基体的膜运输控制系统。因此,KDELR被认为是UPR基因之一。KDELR与肿瘤发生发展密切相关,KDELR与乳腺癌、GBM、非小细胞肺癌、恶性黑色素瘤的发生发展密切相关。KDELR2通过m TOR/HIF1α、调控CCND1促进胶质瘤进展,并可能作为与胶质瘤预后生物标志物,但是其机制仍处于初步阶段,其是否能作为胶质瘤治疗靶点仍缺乏研究。因此,探究靶向KDELR2对胶质瘤细胞生物学功能的改变及对TMZ化疗效果的影响,可能为改善胶质瘤患者的预后提供新的思路。本研究总体分为三部分:1.脑胶质瘤中KDELR2的表达和临床病理相关性分析目的:检测脑胶质瘤组织和胶质瘤细胞中KDELR2的表达情况,初步探讨其与胶质瘤可能存在的关系,为后续研究做准备。方法:收集自2016年1月至2019年9月南昌大学附属九江与医院收治的42例脑胶质瘤患者临床标本,男性23例,女性19例,年龄为47.14±8.74岁,星形胶质细胞瘤14例,胶质母细胞瘤28例;低级别胶质瘤（LGG,WHO分级:Ⅰ～Ⅱ级）9例,高级别胶质瘤（HGG,WHO分级:Ⅲ～Ⅳ级）33例。所有患者标本均为首次手术标本,并且术前未行放化疗。采用免疫组化及western blot方法分别检测脑胶质瘤组织KDELR2的表达情况,采用RT-q PCR胶质瘤细胞系中KDELR2的m RNA水平。结果:在42例行IHC胶质瘤组织中,KDELR2蛋白在HGG组织中呈高表达的趋势,HGG肿瘤组织（2.52±0.71）免疫组化评分高于LGG肿瘤组织（1.89±0.78）,p＜0.05;胶质瘤组织中KDELR2蛋白水平与患者年龄、性别无关。进一步对6位LGG患者和6位HGG患者的肿瘤组织进行了western blot检测发现:KDELR2蛋白在HGG胶质瘤组织中的表达水平高于LGG肿瘤组织。对8位患者的肿瘤和瘤旁组织KDELR2蛋白进行western blot检测发现:KDELR2蛋白在胶质瘤组织中的表达水平高于配对的瘤旁组织。采用RT-q PCR方法检测不同胶质瘤细胞系KDELR的m RNA水平发现:同一细胞株KDELR不同亚型之间的m RNA水平存在差异;不同胶质瘤细胞株KDELR各亚型m RNA水平存在差异;在U251、U373、U118细胞中,KDELR2的m RNA趋势一致。结论:KDELR2在脑胶质瘤中的表达随着肿瘤级别増高而成上升趋势,与胶质瘤病理分级相关。2.RNAi沉默KDELR2基因促进胶质瘤U373调亡及分子机制的初步探讨。目的:采用构建的高效KDELR2的si RNA和过表达质粒转染胶质瘤U373细胞,探讨KDELR2沉默对脑胶质瘤细胞増殖、凋亡的影响及其相关分子机制。方法:设计KDELR2特异性的3对si RNA和阴性对照的si RNA,通过RNAi技术成功敲减U373细胞中KDELR2表达。另构建KDELR2基因过表达质粒p Len O-K2载体,转染U373细胞。分别采用CCK-8法和Colony formation法检测si RNA和p Len O-K2质粒转染对U373细胞增殖和克隆能力的影响。采用流式细胞术和Hochest33258检测si RNA或p Len O-K2质粒转染对U373细胞凋亡的情况。RT-q PCR和western blot分别检测基因（ATF4、ATF6、PERK、e IF2-α、GRP78和CHOP）和蛋白（cleaved caspase 3、caspase 3、cleaved PARP、PARP、Bax、Bcl-2、JNK、p-JNK、p38、p-p38、ATF4、ATF6、XBP-1s、PERK、p-PERK、GRP78和CHOP）的表达。结果:三对si RNA均能有效抑制KDELR2 m RNA和蛋白水平,si RNA1干扰组U373细胞KDELR2 m RNA的表达量为对照组（si-NC）的17.03%±2.04%,干扰效率最高。过表达质粒转染U373细胞后KDELR2 m RNA转录水平是对照组（OE-Ctrl）的1.33±0.05倍。KDELR2沉默显著抑制U373细胞增殖和克隆形成能力,KDELR2过表达促进细胞增殖和细胞克隆形成。KDELR2沉默增加U373细胞凋亡率,上调cleaved PARP、cleaved caspase 3和Bax蛋白水平,KDELR2沉默诱导U373细胞GRP78、ATF6、e IF2α、ATF4、PERK、CHOP基因的m RNA水平显著增加,KDELR2沉默诱导GRP78、ATF6、ATF4、xbp1和CHOP蛋白表达上调,促进PERK和e IF2α激活。KDELR2沉默还激活JNK/p38途径。结论:RNAi沉默KDELR2通过ERS依赖CHOP途径和激活JNK/p38途径促进胶质瘤U373细胞凋亡。3.RNAi沉默KDELR2通过CHOP和JNK/p38途径协同TMZ促进胶质瘤细胞凋亡。目的:探讨KDELR2沉默是协同促进TMZ抗肿瘤活性,研究该协同作用与否CHOP途径和JNK/p38途径密切相关。方法:CCK-8法测定替莫唑胺对U373细胞的IC50,CCK-8法检测KDELR2沉默、TMZ和KDELR2沉默/TMZ对胶质瘤U373细胞增殖,流式细胞仪、Hochest33258检测KDELR2沉默、TMZ和KDELR2沉默/TMZ对胶质瘤U373细胞凋亡的影响。通过western blot检测蛋白（KDELR2、JNK、p-JNK、p38、p-p38、GRP78、CHOP、GAPDH）表达水平,研究相关分子机制。结果:TMZ在U373细胞内的IC50为:301.3μmol/L（95%CI:281.8 to322.1μmol/L）,较KDELR2沉默和TMZ组,KDELR2沉默/TMZ（200μmol/L）组U373细胞增殖进一步被抑制,并且KDELR2沉默/TMZ（200μmol/L）组U373细胞凋亡率进一步增加。与对照组相比,KDELR2沉默/TMZ对U373细胞中KDELR2蛋白的表达明显抑制,进一步激活JNK/p38途径,并且增强了CHOP蛋白的表达。结论:RNAi沉默KDELR2通过CHOP和激活JNK/p38途径协同TMZ促进胶质瘤细胞凋亡。