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中成药特别是中药注射液过敏反应时有发生,已经成为了制约其广泛应用的主要因素,提高过敏反应评控水平对提高其临床用药安全性具有重要的现实意义。目前过敏反应评价方法主要分为2种,分为体内法和体外法。体内法主要指的是传统的动物实验法,然而其因实验周期长、耗时费力、主观性强、准确度差等缺点已经无法满足现代高通量的需求；体外法主要指免疫法和细胞模型法,然而存在假阳性或假阴性率较高等缺点。钙流技术具有简便、高通量、可靠性强等优势；RTCA技术具有实时无标记、高灵敏度等优势。目前,Hariharan Subramanian等报道了MrgX2可引发肥大细胞脱颗粒以及释放组胺,并且,Benjamin D. McNeil等研究人员指出了MrgX2是引发过敏反应的重要的药物靶点。因此,为了解决传统方法中存在的灵敏性差、可靠性差以及无法高通量等缺点,本课题以致敏靶点MrgX2为理论基础,建立了稳定过表达MrgX2的重组细胞模型,此细胞模型可用于致敏物质的评价。在此基础上,建立了基于钙流分析方法的筛选模型,初步探究了基于RTCA平台的评价体系,并且对这两种方法进行了比较。并且应用基于HEK293/MrgX2的钙流筛选模型高通量的评价了180个中药单体化合物。以期为中药质量评控提供更加灵敏有效的方法,从而确保与提高临床用药安全性。主要研究结果如下：第一部分：重组过表达细胞系HEK293/MrgX2的建立首先构建带有红色荧光标签的真核质粒载体pmCherry-C1,然后进行质粒质量的检测,通过电泳检测和紫外分光光度法对质粒的质量和纯度进行了鉴定,结果表明重组质粒的质量和纯度满足转染的需求。通过稳定转染法,将pmCherry-Cl-MrgX2转染HEK293母细胞,经抗生素G418筛选后获得32株转染成功的细胞株,通过钙流检测获得成功过表达MrgX2的单克隆细胞系,选取状态良好、敏感性、稳定性较高的单克隆细胞株进行接下来研究。第二部分：基于钙流和RTCA分析方法的两种评价模型的建立与探究首先验证了HEK293/MrgX2细胞系的功能性和稳定性,以C48/80为阳性激动剂,2-APB为阳性拮抗剂,采用钙流检测方法进行EC50、IC50的验证,结果EC50的值与文献报道的基本一致；本研究首次报道了2-APB拮抗C48/80引发MrgX2产生钙流信号的IC50,且IC50的值与2-APB拮抗其他受体时的IC50相差不大；在细胞系Po-P30范围内,每隔5代测一次EC50,结果表明了细胞系的稳定性足够满足筛选体系的需求。因此,HEK293/MrgX2细胞系可用于筛选MrgX2特异性配体。为了验证钙流筛选体系的稳定性和可靠性,应用Z因子进行评估,Z=0.77,结果表明了此钙流筛选模型能够满足高通量筛选的需求。在探究RTCA分析方法时依次检测了EC50、IC50、Z因子。结果表明在RTCA评价体系中,C48/80和2-APB对MrgX2的作用均表现了剂量依赖性,EC50=3.6μg·mL-1, IC50=46.29μmol·L-1。本研究首次报道了RTCA检测体系之中,C48/80和2-APB对致敏受体MrgX2的作用呈现剂量依赖效应。为了检测该体系的稳定性和可靠性,评估了该方法的Z因子,Z=0.87,则说明该评价体系足够稳定和可靠。鼠源肥大肥大细胞RBL-2H3内源性表达MrgX2同源基因MRGPRB2,本研究检测了C48/80对RBL-2H3的影响,EC50=3.7μmol·L-1,与文献报道基本一致。因此,本研究初步建立了基于RTCA分析方法的评价体系。随后,通过比较EC50、IC50、Z因子进行了两种分析方法的比较,结果表明本课题可以结合两种方法体系来进行致敏物质的评价和验证,使结果更加真实可靠。第三部分：两种评价模型的应用依据前期建立的基于HEK293/MrgX2的高通量钙流评价模型,进行了180个中药单体化合物的筛选,发现了4个文献未报道的MrgX2激动剂,青藤碱、莲心碱、异莲心碱以及甲基莲心碱,EC50值分别为1.997μmol·L-1、8.924 μmol·L-1、10.31μmol·L-1、10.29 μmol·L-1。阳性拮抗剂2-APB拮抗的IC50分别是31.55μmol·L-1、.37.76μmol·L-1、22.11 μmol·L-1、68.94μmol·L-1。为了验证4个阳性化合物是MrgX2的特异性激动剂,首先检测HEK293母细胞的激动作用,随后,检测了其余6个与感觉相关的受体,TRPA1、TPRV1、TRPV2、TRPV3、TAS2R和ETB受体,结果表明了不能激活HEK293内源性受体和其余6个受体,因此,4个阳性化合物是MrgX2的特异性激动剂。为了观察MrgX2激动剂对HEK293是否有细胞毒性,实验中选用ATP GlO细胞荧光活性检测的方法在HEK293/MrgX2细胞系上对筛选得到的阳性中药化合物进行24 h细胞毒性评价。结果表明MrgX2激动剂青藤碱、莲心碱、异莲心碱以及甲基莲心碱未表现出细胞毒性。其次,本课题进行了清开灵注射液单体化合物对MrgX2的激动作用,结果无阳性化合物。进而,本课题利用实时无标记电阻检测技术对筛选结果进行验证,莲心碱、异莲心碱以及甲基莲心碱均在RTCA体系中得到了阳性验证结果,证明了 RTCA平台的可靠性.通过分子靶点与致敏作用指点的关联性,本课题构建了可用于评价过敏反应的HEK293/MrgX2体外细胞模型。基于过表达MrgX2的HEK293/M1gX2细胞和内源性表达MRGPRB2的RBL-2H3细胞,构建了高通量的钙流模型和RTCA模型。通过钙流及RTCA平台筛选及评价体系,得到中药单体与致敏靶点直接作用关系,找到了潜在致敏物质,从分子靶点层面探讨了中药引发过敏反应的机制。为更加有效地解决中药过敏问题提供新的研究思路和研究模式。