论文部分内容阅读
本文研究内容分为三部分：
第一部分：研究水通道蛋白4(aquaporin 4，AQP4)在体外培养大鼠星形胶质细胞中的表达规律。
方法:取新生1天Wistar大鼠脑皮层进行星形胶质细胞原代培养，约10天传代，传代培养至10天左右，用胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)免疫细胞化学染色检测鉴定星形胶质细胞的纯度。分别于原代培养3、5、7、9天及传代培养9天提取星形胶质细胞总RNA，逆转录反应合成cDNA，实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR)检测AQP4和β-actin含量，用AQP4/β-actin比值表示AQP4 mRNA表达水平。
结果:
1) GFAP免疫细胞化学染色显示95％以上培养细胞染色阳性。
2)大鼠星形胶质细胞在原代培养3、5、7、9天及传代培养9天的AQP4 mRNA表达水平分别为2.18±1.24、1.71±0.28、6.00±1.20、8.66±0.81及11.81±3.02，说明星形胶质细胞AQP4 mRNA在原代培养3天就有AQP4 mRNA表达， 5天时没有显著变化(P>0.05)，7天表达显著升高(P<0.05)，9天持续升高(P<0.05)；星形胶质细胞传代培养9天与原代培养9天AQP4 mRNA表达没有差异(P>0.05)。
结论:随培养星形胶质细胞成熟，AQP4表达逐渐增加，发挥其调节水平衡的功能。
第二部分:建立大鼠星形胶质细胞体外培养划痕损伤模型。
方法:大鼠星形胶质细胞传代培养至10天左右，GFAP免疫细胞化学染色证实培养细胞中星形胶质细胞达95％以上用于实验。用白色无菌Tips头在培养板中呈“＃”字划痕损伤，划痕线之间的平行间距为0.5 cm，对照组未进行任何处理。分别于划痕损伤前1 h、划痕损伤后1、3、6、12、24 h在倒置相差显微镜下观察细胞形态变化；分别于划痕损伤前10 min、划痕损伤后1、12、24 h进行GFAP免疫细胞化学染色；分别于划痕损伤前1 h、划痕损伤后1、3、6、12、24 h取其培养液0.1 ml进行乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)活性测定；于划痕损伤后24 h取培养细胞按照Bradford法进行蛋白(protein，pro)测定，LDH漏出量以LDH测定值/pro测定值(U/mg蛋白)表示。
结果:
1)倒置相差显微镜下观察对照组细胞在实验24 h内形态没有变化。实验组在划痕损伤即刻及划痕损伤后1、3 h，划痕两侧边缘整齐，部分细胞形态由扁平形变为不规则形，部分细胞结构不完整；划痕损伤后6 h划痕两侧开始出现细胞突起向划痕区延伸；划痕损伤后12、24 h向划痕区延伸的细胞突起增多，且划痕区出现星形胶质细胞生长。
2)GFAP免疫化学染色显示，划痕损伤后1 h实验组划痕两侧细胞GFAP免疫化学染色加重；划痕损伤后12 h，划痕两侧细胞胞体肥大、突起增粗，阳性细胞数增多；划痕损伤后24 h，向划痕中心延伸的阳性细胞数显著增加，划痕区出现阳性细胞。
3)对照组(n=9)在实验各时间点的LDH/pro值分别为41.16±4.9、43.10±4.66、44.68±5.50，47.88±5.85、52.62±5.59、57.77±5.87(U/mg)；实验组(n=9)各时间点的LDH/pro值分别为40.85±3.34、48.79±3.35、50.92±3.69、53.38±3.96、58.70±3.85、62.16±2.65(U/mg)。实验说明实验组与对照组细胞LDH漏出量在划痕损伤前没有差异(P>0.05)；而划痕损伤后实验组细胞LDH漏出量在1 h内迅速增加，随时间延长继续增加，各时间点与划痕损伤前相比差异均有统计学意义(P<0.05)。对照组细胞在实验6 h后亦出现LDH漏出量增加(P<0.05)，但在划痕损伤后各时间点实验组细胞LDH漏出量均高于对照组(P<0.05)。
结论:星形胶质细胞划痕损伤后出现细胞形态改变、GFAP免疫化学染色的变化及培养液中LDH漏出量增加，证实已成功建立了体外培养大鼠星形胶质细胞划痕损伤模型。
第三部分:研究体外培养大鼠星形胶质细胞划痕损伤后水通道白4(aquaporin 4，AQP4)表达变化，以及丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)信号通路抑制剂对AQP4表达的影响。
方法:复制体外培养大鼠星形胶质细胞划痕损伤模型，分别在划痕损伤前及划痕损伤后1、12、24 h收集细胞提取总RNA用实时荧光定量聚合酶链反应(real-timequantitative polymerase chain reaction，RT-PCR)技术检测AQP4 mRNA表达；同时收集细胞提取蛋白用免疫印迹法检测AQP4蛋白表达。MAPKs抑制剂干预实验分为五组：对照组、划痕损伤组(损伤组)、划痕损伤+DMSO(DMSO对照组)、划痕损伤+U0126(U0126组)、划痕损伤+SP600125(SP600125组)。划痕损伤前1 h换液，分别在各孔培养基中加入DMSO、细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated protein kinases，ERK)抑制剂U0126、c-jun氨基端激酶(c-JUN N-terminal kinases，JNK)抑制剂SP600125，终浓度分别为0.2％、10 pmol/1、20 μmol/1；划痕损伤12 h后，提取星形胶质细胞总RNA进行RT-PCR检测AQP4mRNA表达水平。
结果:
1)RT-PCR实验显示AQP4 mRNA在细胞划痕损伤前1 h、划痕损伤后1、12、24 h分别为1.43±0.5、1.21±0.43、0.61±0.28、0.63±0.32，与划痕损伤前相比，AQP4 mRNA在划痕损伤后1 h没有变化(P>0.05)，划痕损伤后12、24 h明显降低(P<0.05)，划痕损伤后24 h略有回升(P>0.05)。免疫印迹实验证实在细胞划痕损伤后12 h星形胶质细胞AQP4蛋白表达降至最低，之后回升。
2)MAPKs抑制剂干预实验对照组、损伤组、DMSO对照组、U0126组、SP600125组星形胶质细胞AQP4 mRNA表达水平分别为0.98±0.02、0.73±0.09、0.71±0.08、2.85±0.82、1.18±0.59，与对照组比，损伤组及DMSO对照组的AQP4 mRNA表达水平显著降低(P<0.05)；与损伤组相比，DMSO对照组的AQP4 mRNA表达水平没有显著变化(P>0.05)，U0126组AQP4 mRNA表达水平显著增高(P<0.05)，SP600125组AQP4 mRNA表达水平没有显著变化(P>0.05)。
结论:星形胶质细胞划痕损伤引起AQP4表达下调，ERK抑制剂U0126可对抗此变化，提示ERK可能参与星形胶质细胞划痕损伤后AQP4表达调节，为进一步阐明脑水肿发生的分子机制提供实验依据。