论文部分内容阅读
美达霉素是一种芳香聚酮类抗生素,研究表明其具有潜在的抗菌、抗肿瘤等活性。其基因簇中med-ORF8编码C-糖基转移酶（C-glycoysltransferase, C-GT）,催化一个稀有氨基糖胺与聚酮母核以C-C糖苷键的方式进行连接；另一基因med-ORF10编码一个小调控蛋白,参与美达霉素的生物合成调控,但机制未知。本文利用Red/ET无痕修饰、凝胶迁移、酵母双杂交等实验方法,对这两个功能基因med-ORF8和med-ORF10进行研究,内容包括以下几个方面：（1）通过点突变研究C-糖基转移酶Med-ORF8的作用机制将包含Med-ORF8在内多个C-GT与O-GT的基因序列进行比对分析,确定了几个明显的差异点,它们可能决定两类GT催化活性的差异。本研究对Med-ORF8中一个可能的活性位点(I307)进行点突变(I307突变为D307),以探究这种点突变是否会影响Med-ORF8的催化活性。本实验利用Red/ET重组、ccdB反向筛选的方法,将一个7基因（六个可能的糖基合成酶基因和一个糖基转移酶基因）共表达质粒pAYT55中的糖基转移酶基因med-ORF8替换成med-ORFS* (I307突变为D307),然后将med-ORF8替换后的质粒pAYT55*通过结合转移导入天蓝色链霉菌B135（据报道能够积累未糖基化的底物）中,对发酵产物进行HPLC/MS及HRMS分析。研究结果表明,链霉菌B135确实可以积累一种与美达霉素的母核结构一致的中间产物kalafungin;对照菌（B135/pAYT55）中可以产生美达霉素（pAYT55编码的糖基合成酶和糖基转移酶负责kalafungin的C-糖基化从而合成美达霉素）；菌株B135/pAYT55*依然能产生美达霉素,并没有新的化合物产生,说明我们突变的位点I307可能并不是决定C-GT活性的关键性位点,尽管此位点在C-GT中具有高度保守性。（2）调控蛋白Med-ORF10与DNA之间的相互作用初探前期研究表明,med-ORF10是美达霉素生物合成基因簇中的一个正效调控基因,而且该基因簇中包含med-ORF10的调控靶基因。Med-ORF10具体的调控机制仍不清楚,但可确定它不含DNA-Binding结构域。已经研究发现Med-ORF10不能与靶基因之一med-ORF12的启动子结合。本研究通过凝胶阻滞实验来探究Med-ORF10是否可与另一个靶基因med-ORF29可能的启动子区域有直接结合作用：通过PCR的方式获得med-ORF29可能的启动子区域（149bp的DNA片段Pmed-ORF29）,进行生物素标记,并检测标记效率。大量表达纯化获得Med-ORF10蛋白,并进行透析浓缩。然后将标记好的Pmed-ORF29与Med-ORF10蛋白质共孵育,通过非变性的聚丙烯酰氨凝胶电泳分离,最后利用化学发光法进行检测。结果表明,在目前的实验条件下,Med-ORF10与Pmed-ORF29之间并没有明显的结合作用。（3）利用酵母双杂交筛选与Med-ORF10相互作用的蛋白利用EMSA并没有确定能够与Med-ORF10蛋白相互作用的DNA区域,推测Med-ORF10的调控作用可能并不是通过与DNA直接作用来完成的,而是通过蛋白间的相互作用来间接的调控转录过程,因此,我们选择利用酵母双杂交实验来筛选可能与Med-ORF10有相互作用的蛋白质。首先,利用部分酶切法构建了美达霉素产生菌AM-7161的基因组文库,将酶切后的DNA片段连接到质粒pGBKT7上,组成“猎物”蛋白文库。然后,将med-OKF10基因克隆到另一个质粒pGADT7上,构建了“诱饵”质粒,并对诱饵质粒进行毒性和自激活检测。下一步,将“诱饵”质粒和“猎物”质粒都转到酵母宿主细胞Y2Hgold中,通过下游报告基因的表达情况来筛选目的蛋白,得到的阳性克隆质粒经测序得到其DNA序列。最终,我们获得了3个可能与Med-ORF10有相互作用的质粒,其插入片段所编码的结构域分别属于SPRYPRYTRIM76家族、PGRP家族、Amidinotransferases superfamily家族。