结核病,一种由结核分枝杆菌感染引起的传染性疾病,一直以来都威胁着全球的公共健康。近些年由于艾滋病结核共感染以及多重耐药结核分枝杆菌菌株的出现,现有的结核药物已经不能满足治疗结核病和控制结核病传播的需求。因此,开发新的抗结核药物或者探索传统药物在治疗结核方面的新作用是一个紧迫的任务。现阶段抗结核药物筛选方法主要有两种:一种是表型筛选（全细胞筛选）;另一种是基于特异性靶标进行的化合物筛选。本课题就是基于上述的两种筛选方法开展的。耻垢分枝杆菌,一种生长迅速、无病原性且与结核分枝杆菌有着相同的细胞壁结构的模式菌,常被用来代替结核分枝杆菌进行相关研究。课题组以耻垢分枝杆菌为模式菌进行表型筛选,发现黄连素具有抑制耻垢分枝杆菌生长的活性。黄连素一种异喹啉类生物碱,从防己科、毛莨科和小檗科等植物中提取而来,有抗微生物感染、抗炎以及抗肿瘤等药理活性。本研究探讨黄连素抑制耻垢分枝杆菌的机制,将有助于推动抗结核新药的研发。结核分枝杆菌有着独特的细胞壁结构,是细菌生存的基础,其中肽聚糖是构成细胞壁的主要成份之一。N-乙酰胞壁酸与N-乙酰葡糖胺交替连接构成肽聚糖的基本骨架结构,而本文研究的UDP-N-乙酰葡糖胺烯醇丙酮转移酶（MurA）是催化N-乙酰胞壁酸合成的关键酶,在分枝杆菌细胞壁合成过程中发挥重要作用。murA是结核分枝杆菌生长必需基因,且哺乳动物体内并没有MurA酶以及与N-乙酰胞壁酸相似的代谢途径,因此,本实验选择MurA酶作为筛选抗结核药物的靶点。本论文的研究目的:1.以耻垢分枝杆菌为模式菌,研究黄连素对分枝杆菌生长、形态、结构、蛋白质组、药物敏感性以及生物膜的影响。2.建立结核分枝杆菌MurA酶抑制剂筛选系统,筛选结核分枝杆菌MurA酶特异性抑制剂。本论文的研究结果:1.黄连素抑制分枝杆菌的作用机理研究耻垢分枝杆菌在不同浓度的黄连素下培养,生长曲线、CFU曲线证明了黄连素可以有效抑制耻垢分枝杆菌生长。利用扫描电镜和透射电镜观察经黄连素孵育24h后的耻垢分枝杆菌细菌形态以及结构,结果显示黄连素可以引起耻垢分枝杆菌形态以及结构异常。菌体明显增大变长,细胞表面出现明显褶皱而且细胞内容物出现不同程度的减少。通过SDS-PAGE,MS及RT-PCR检测,发现黄连素对耻垢分枝杆菌蛋白质的表达有影响:可以加强DNA拓扑异构酶Ⅱ（DNA旋转酶）B亚基以及TetR家族转录调节蛋白的表达;可以使DNA结合蛋白的表达减少。采用刃天青微孔板实验法检测五种一线抗结核药物对有无黄连素条件下耻垢分枝杆菌MIC,我们发现黄连素能增加耻垢分枝杆菌对抗结核药物异烟肼（INH）,利福平（RMP）,链霉素（STR）的敏感性。通过检测黄连素对耻垢分枝杆菌生物膜的影响,我们发现黄连素不仅能抑制耻垢分枝杆菌生物膜的形成还能破坏成熟的耻垢分枝杆菌生物膜。2.基于MurA靶点的酶抑制剂筛选利用分子克隆技术构建大肠杆菌MurA酶表达菌株,用纯化的MurA酶测定其酶促反应动力学参数。通过比较变形链球菌、大肠杆菌、耻垢分枝杆菌和结核分枝杆菌来源的MurA酶学参数,发现四种MurA酶的催化特性存在差异。建立了结核分枝杆菌MurA酶抑制剂筛选系统,从海洋次生代谢产物以及中药化合物库中筛选出结核分枝杆菌MurA酶特异性的抑制剂。结论:1.黄连素可导致耻垢分枝杆菌细菌形态及结构异常,蛋白质的表达水平发生变化,抗结核药物INH、RMP、STR的敏感性增加,生物膜形成能力以及成熟生物膜的稳定性下降。综上所述,黄连素具有潜在的治疗结核病的功能。2.海洋次生代谢产物库中,编号#0025和#0030的化合物能特异性抑制结核分枝杆菌MurA酶活性。未来研究方向:1.进一步优化蛋白质组学研究方法,发现更多黄连素作用而引起表达水平变化的蛋白质,分析蛋白质相互作用通路,进一步阐明黄连素的作用机制。2.扩大天然化合物库的数量以及种类,筛选有MurA酶抑制活性的单体化合物,并根据酶促反应动力学参数确定抑制剂的类型。3.通过蛋白结晶或者同源建模获得结核分枝杆菌MurA的空间结构,进一步阐明抑制剂作用于结核分枝杆菌MurA酶的机制。4.建立针对MurA酶的计算机模拟筛选平台,以提高发现MurA酶抑制剂的效率。