论文部分内容阅读
目的:观察白藜芦醇对脊髓损伤大鼠后肢功能的影响,探讨白藜芦醇对脊髓损伤后自噬流的调控作用及其相关机制,为进一步应用白藜芦醇治疗脊髓损伤提供理论基础。 方法:应用改良Allen’s法构建大鼠脊髓损伤模型,将SD大鼠随机分为假手术组、SCI组和白藜芦醇组。各组经过相应干预后,术后第7天取部分大鼠损伤中心处脊髓行尼氏染色,并在术后第1、3、7、14、21和28天分别对其余大鼠行BBB评分及斜板实验等后肢功能评分。 应用改良Allen’s法构建大鼠脊髓损伤模型,将SD大鼠随机分为假手术组、SCI组、白藜芦醇组、白藜芦醇+氯喹组和氯喹组。各组经过相应药物干预后,术后第3天取部分大鼠损伤中心处脊髓行westernblot实验以及免疫荧光双标实验,术后第7天取部分大鼠损伤中心处脊髓行尼氏染色,并在术后第1、3、7、14、21和28天分别对其余大鼠行BBB评分及斜板实验等后肢功能评分。 应用改良Allen’s法构建大鼠脊髓损伤模型,将SD大鼠随机分为假手术组、SCI组、白藜芦醇组。各组经过相应干预后,术后第3天取部分大鼠损伤中心处脊髓行westernblot实验检测LKB1、AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR、p70s6k、p-p70s6k蛋白水平的表达。 应用H202构建PC12细胞氧化损伤模型,将细胞分为control组、H202组、H202+白藜芦醇组、H2O2+白藜芦醇+compoundC组和ItCh+compoundC组。各组经过相应药物干预后,行westernblot实验检测LC3、p62、AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR、p70s6k、p-p70s6k蛋白水平的表达。 将PC12细胞分为空白对照组、control siRNA组以及LKB1 siRNA组。各组经过相应药物干预后,行定量PCR实验以及westernblot实验。再将细胞分为control组、H2O2组、H202+control siRNA组、H2O2+白藜芦醇+LKB1 siRNA组和control+H2O2+LKBl siRNA组。各组经过相应药物干预后,行westernblot实验检测LKB1、AMPK、p-AMPK蛋白水平的表达。 结果:尼氏染色结果显示假手术组相比,脊髓损伤后保留的运动神经元数量显著减少。但白藜芦醇组保留的运动神经元数目显著多于SCI组。脊髓损伤后BBB评分和斜板倾斜角度较假手术组显著降低,白藜芦醇组的BBB评分和斜板倾斜角度在损伤后7、14、21和28天显著高于SCI组。 我们采用Westernblot检测C-caspase3、Bax和Bel-2的水平。与假手术组相比,SCI组C-caspase3水平显著升高;白藜芦醇组C-caspase3水平较SCI组显著降低。此外,与假手术组相比,SCI组Bax/Bel-2比值显著升髙,而白藜芦醇组Bax/Bcl-2比值较SCI组降低。我们采用免疫荧光染色法发现SCI组C-caspase3阳性神经元明显多于假手术组,而经过白藜芦醇处理,C-caspase3阳性神经元的数量较SCI组显著减少。与假手术组相比,SCI组LC3-II/I的比率显著升高,而白藜芦醇组中LC3-II/I的比率更高。我们用免疫荧光双标法在神经元中液发现LC3的表达呈现出类似的趋势。与假手术组相比,SCI后p62的水平显著升高,但白藜芦醇组中的p62水平显著低于SCI组。白藜芦醇+CQ组的LC3-II/1比值显著高于白藜芦醇组和CQ的单独分组。同时,白藜芦醇+CQ组p62水平明显高于白藜芦醇组,而白藜芦醇+CQ组p62水平明显低于CQ组。CQ组和白藜芦醇+CQ组的C-caspase3水平和Bax/Bd-2比率较白藜芦醇组显著增加。免疫荧光双标结果还显示,CQ组和白藜芦醇+CQ组的C-caspase3阳性神经元数量与白藜芦醇组相比显著增加。尼氏染色显示白藜芦醇组保留的运动神经元的数量明显多于CQ组和白藜芦醇+CQ组。BBB评分和斜板实验中斜板的倾斜角度在术后第7、14、21和28天均显著髙于CQ组和白藜芦醇+CQ组。 我们采用Westernblotts检测LKB1、AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR、p70s6k和p-p70s6k的蛋白表达水平。SCI组LKB1和p-AMPK/AMPK的表达水平与假手术组相比显著增加,而白藜芦醇组进一步增加了LKB1和p-AMPK的表达。然而,SCI组中p-mTOR/mTOR和p-p70S6k/p70S6k的比率与假手术组相比显著降低,并且在白藜芦醇进一步降低了p-mTOR/mTOR和p-p70s6k/p70s6k的比率。 与对照组相比,H2O2组PC12细胞中的LC3-II/I比率和P62水平显著上调。而白藜芦醇处理后LC3-II/I比值进一步增加,P62水平降低。此外,白藜芦醇组的LC3-II/I比值显著高于白藜芦醇+cpdC组和单独的cpdC组,P62水平显著低于白藜芦醇+cpdC组和单独的cpdC组。与对照组相比,H2O2组PC12细胞中p-AMPK/AMPK比值显著升髙,p-mTOR/mTOR比值和p-p70s6k/p70s6k比值显著降低。白藜芦醇处理PC12细胞后,p-AMPK/AMPK比值进一步显著升髙,p-mTOR/mTOR比值和p-p70s6k/p70s6k比值进一步显著降低。然而,白藜芦醇组中p-AMPK/AMPK的比率显著高于白藜芦醇+cpdC组和cpdC组,并且p-mTOR/mTOR和p-p70s6k/p70s6k的比率显著低于白藜芦醇+cpdC组和cpdC组。白藜芦醇处理PC12细胞后,LKB1水平和p-AMPK/AMPK比值较H2O2组显著升高。 LKB1 siRNA组的LKB1mRNA水平较control siRNA组显著降低,且LKB1 siRNA组的LKB1蛋白水平亦较control siRNA组显著降低;而control siRNA组的LKB1mRNA水平和蛋白水平与空白对照组相比均没有显著变化。但用LKB1 siRNA转染PC12细胞沉默LKB1的表达之后,白藜芦醇+LKB1 siRNA组和LKB1 siRNA组的p-AMPK/AMPK的比值均显著低于白藜芦醇组。 结论:脊髓损伤可导致神经元自噬流受损,而白藜芦醇可通过LKB1/AMPK/mTOR/p70s6k信号通路修复脊髓损伤后受损的神经元自噬流并抑制其凋亡,从而改善脊髓损伤后大鼠的后肢功能。