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第一部分:Apelin在PCOS血清的表达及意义研究背景Apelin是新近发现的脂肪因子,其在能量代谢与胰岛素抵抗(Insulin resistance,IR)方面发挥着改善糖、脂代谢及抗肥胖的重要作用,还可能以“保护因子”的角色参与二型糖尿病、高血压及动脉硬化的发病过程。但Apelin在多囊卵巢综合症(Polycystic ovary syndrome,PCOS)这一特殊能量代谢异常群体中的作用目前尚不明确。研究目的:检测PCOS患者血清Apelin水平,了解Apelin和肥胖、糖代谢、脂代谢等相关临床生化指标之间的相互关联,并进一步探讨脂肪因子Apelin对肥胖、能量代谢以及PCOS发生、发展过程的可能作用机理。研究方法:筛选郑州人民医院行健康体检的PCOS患者100例作为实验组,同期女性健康体检客户100例作为对照组;实验组与对照组均按照BMI≥25kg/㎡标准进行肥胖与非肥胖的亚组分型:其中肥胖PCOS组62例,非肥胖PCOS组38例;肥胖对照组50例,非肥胖对照组50例。所有对象采集外周循环血清20ml,均经受检者知情同意后方可用于实验。采用ELISA测定血清Apelin水平;同时测定卵泡刺激素(Follicle-stimulating hormone,FSH)、雌二醇(Estrodiol,E2)以及黄体生成素(Luteinizing Hormone,LH)、孕酮(Progesterone,P)、睾酮(Testosterone,T)的血清浓度;电化学发光法检测受试者空腹血糖(Fasting blood glucose,FBG)、胰岛素(insulin,INs)、甘油三酯(Total cholesterol,TC)以及总胆固醇(Triglycerides,TG)、高密度脂蛋白(High density lipoprotein,HDL)、低密度脂蛋白(Low density lipoprotein,LDL)水平。结果:1.PCOS组血清Apelin水平显著高于正常对照组(647.92±194.47)vs(478.26±178.4);肥胖PCOS组Apelin水平显著高于非肥胖PCOS组及肥胖对照组(698.78±177.25)vs(512.39±191.32)vs(537.54±201.65),差异均有统计学意义(P<0.05)。2.PCOS组与对照组相比,BMI、WHR、LH、E2、T、FPG、GHB、FINS、HOMA-IR、TG、LDL、Apo B、TC/HDL、LDL/HDL各项指标均有统计学差异(P<0.05或P<0.01);FSH、P、TC、HDL、Apo A组间无统计学差异(P>0.05)。3.PCOS肥胖组与非肥胖组相比,LH、GHB%、TG、LDL、Apo B、TC/HDL、LDL/HDL有统计学差异;且无论PCOS存在与否,肥胖组与非肥胖组间均存在统计学差异的有BMI、WHR、E2、T、FINS、HOMA-IR(P<0.05或P<0.001)。4.血清Apelin水平与BMI、FINS和HOMA-IR呈正相关;r值依次为0.609、0.498、0.457(P<0.05);Apelin与LH水平负相关,r值-0.548(P<0.05);Apelin与其他因素Age、FSH、E2、P、T、FPG、TC、TG、LDL-C、HDL-C、Apo B等无相关性。多元线性回归分析显示PCOS、BMI是影响Apelin水平的显著因素(P<0.05)。结论:1.PCOS患者血清Apelin水平较非PCOS女性显著升高。2.Apelin水平与肥胖程度和IR指数正相关。3.Apelin可能促进胰岛素分泌,参与血糖调节,参与PCOS代谢紊乱的发生与发展。第二部分:Apelin在PCOS原代颗粒细胞m RNA水平与蛋白的表达研究背景Apelin是能量代谢过程中的重要调节因子,在小鼠及牛卵巢颗粒细胞具有表达,呈曲线样水平存在。PCOS的异常排卵是其重要临床特征,而颗粒细胞是调控排卵发生的重要位点。现已明确生长分化因子9(Growth differentiation factor 9,GDF-9)与叉头转录因子1-a(Forkhead box O1-a,Foxo1a)均直接参与PCOS颗粒细胞增殖与凋亡的异常调控。但截至目前,尚未见Apelin在人卵巢颗粒细胞的表达以及Apelin与GDF-9、Foxo1a相关性的报道。研究目的:检测PCOS患者原代培养颗粒细胞Apelin m RNA水平与蛋白的表达,并与第一部分PCOS患者血清Apelin水平进行相互验证;同时检测与PCOS密切相关因子GDF-9和Foxo1a的m RNA水平及蛋白的表达,了解Apelin与之相互关联,进而深入探讨Apelin在卵泡发育过程中可能发挥的作用。研究方法:收集郑州大学第一附属医院生殖中心行体外受精(In vitro fertilization,IVF)试管婴儿的PCOS患者取卵日(Ovum pick-up,Opu)卵泡液,提取颗粒细胞作为实验组,同期因输卵管因素或男方因素行IVF患者来源的颗粒细胞作为对照组,以体重指数(Body Mass Index,BMI)≥25kg/㎡为肥胖与非胖亚组分型标准。分别用定量逆转录聚合链反应(Reberse transcription polymerase chain reaction,RT-q PCR)与蛋白印迹(Western Bloting,W-b)法检测四组颗粒细胞Apelin、Foxo1a及GDF-9的m RNA水平与蛋白表达,分析Apelin在颗粒细胞的表达与血清Apelin水平趋势是否一致,同时了解颗粒细胞Apelin水平与Foxo1a、GDF-9表达的相关性。结果:1.PCOS组与对照组颗粒细胞均可见Apelin、GDF-9及Foxo1a的m RNA与蛋白的阳性表达;2.PCOS组颗粒细胞Apelin m RNA水平与蛋白表达均显著高于正常对照组;且这种差异存在于肥胖与非肥胖组之间,无论患者罹患PCOS与否,组间差异均有统计学意义(P<0.05)。3.PCOS肥胖组颗粒细胞Foxo1a m RNA水平显著高于非肥胖组和正常对照组;蛋白表达各组间均有统计学差异(P<0.05),尤以PCOS肥胖组蛋白表达最显著。4.PCOS组颗粒细胞GDF-9 m RNA水平显著低于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.05),但在肥胖与非肥胖组间无差异(P>0.05);蛋白表达各组间均有统计学差异,以PCOS肥胖组表达最低(P<0.05)。5.Apelin与Foxo1a的m RNA水平呈正向关联,与GDF-9的m RNA水平呈负向关联。结论:1.PCOS卵巢颗粒细胞Apelin、Foxo1a的m RNA水平及蛋白表达显著升高,GDF-9 m RNA水平及蛋白表达显著降低。2.Apelin水平与Foxo1a、GDF-9水平密切相关联,其可能参与PCOS异常卵泡发育过程。第三部分:Apelin影响卵巢颗粒细胞的增殖与凋亡研究背景Apelin参与人体多种细胞增殖与分化调节,在抵抗肥胖与IR方面发挥着积极重要的作用。肥胖本身即可促进卵泡的异常发育,颗粒细胞的增殖与凋亡是卵泡发育或闭锁的必然结果;前部分研究结果表明Apelin在人PCOS颗粒细胞具有高表达,与GDF-9、Foxo1a这两个调控颗粒细胞增殖与凋亡的重要因子有明确关联性,但Apelin是否对人颗粒细胞的增殖与凋亡发生影响未见相关研究。研究目的:了解Apelin对颗粒细胞增殖与凋亡的影响作用,探讨Apelin在卵泡发育微环境中可能的调控机理。研究方法:实验材料同第二部分,收集因男方因素或输卵管因素不孕而行IVF女性的卵泡液,提取颗粒细胞进行原代培养,贴壁生长后按照添加不同培养液进行分组:添加Apelin培养基的为实验组(高浓度组:Apelin10-6mol/L、低浓度组:Apelin10-8mol/L),添加等容量无血清DMEM/F12的培养液做为对照组。继续培养12h、24h、48h后分别采用MTT-OD法和Annexin V-FITC/PI法检测Apelin对颗粒细胞的增殖与凋亡效果。结果:1.Apelin对颗粒细胞有促进增殖的作用,12h、24h、48h分别检测MTT-OD值:Apelin低浓度组(0.327±0.033)vs(0.562±0.046)vs(0.669±0.018);Apelin高浓度组(0.283±0.015)vs(0.544±0.038)vs(0.567±0.051);对照组(0.149±0.017)vs(0.295±0.011)vs(0.321±0.024);各相同时间点实验组较对照组细胞增殖显著增高,有统计学差异(P<0.05);尤以低浓度组作用48小时颗粒细胞增殖效果最强(P<0.05)。2.Apelin对颗粒细胞有抑制凋亡作用,12h、24h、48h凋亡率:Apelin低浓度组(8.21±0.53)%vs(11.41±1.01%)vs(7.12±0.89)%;高浓度组(10.15±0.73)%vs(14.86±1.47)%vs(18.64±1.76)%;对照组(12.94±1.29)%vs(21.93±1.65)vs(23.64±1.76)%;各相同时间点实验组与对照组凋亡率均有差异(P<0.05);以低浓度组作用48小时颗粒细胞凋亡率最低(P<0.05)。结论:Apelin对颗粒细胞有促进增殖、抑制凋亡的作用,当Apelin浓度为10-8mol/L且作用48小时效果最显著。第四部分:Apelin通过激活PI3K/Akt信号通路调节GDF-9、Foxo1a、Bcl-2的表达与颗粒细胞的增殖与凋亡研究背景PI3K/Akt信号通路是细胞增殖与凋亡的重要通路之一,多种细胞因子通过激活Akt蛋白调控下游基因而参与细胞功能的调节。Apelin是否可通过活化Akt信号蛋白调控下游基因GDF-9、Foxo1a、Bcl-2的表达;以及Apelin是否可通过PI3K/Akt信号通路对颗粒细胞促增殖、抑凋亡发挥作用目前尚不知晓。研究目的:了解Apelin是否通过PI3K/Akt信号通路调控下游基因Foxo1a、GDF-9与BCL-2,进而阐述Apelin在PCOS疾病发生及转归过程中的可能调控作用。研究方法:实验材料同第二部分,收集因男方因素或输卵管因素不孕而行IVF女性的卵泡液,提取颗粒细胞进行原代培养,24小时后观察Apelin对信号Akt蛋白的磷酸化作用;采用Apelin-si RNA技术、PI3K阻断剂LY294002、Akt信号阻断剂HIMO对颗粒细胞进行转染干预处理,处理12h、24h、48h分别检测MTT-OD值,了解Apelin对于干预处理后颗粒细胞的增殖与凋亡作用;采用RT-PCR和W-b对转染后蛋白Akt、P-Akt、Foxo1a、GDF-9及BCL-2的m RNA水平与蛋白表达进行检测。结果:1.Apelin可激活PI3K/Akt通路信号蛋白Akt,使其磷酸化;30分钟磷酸化达到高峰;Apelin-si RNA组、PI3K信号阻断剂LY294002组、Akt信号阻断剂HIMO组均可抑制信号蛋白Akt激酶的磷酸化。2.Apelin-si RNA对细胞进行转染干预处理,48小时转染率最高达60%。3.Apelin-si RNA组、PI3K信号阻断剂LY294002组与Akt信号阻断剂HIMO三组均可抑制Apelin对颗粒细胞的增殖与凋亡作用。4.Apelin作用被阻断后,下游Foxo1a m RNA水平与蛋白表达上调,GDF-9、Bcl-2 m RNA水平与蛋白表达下调。结论:Apelin通过活化PI3K/Akt信号通路的Akt蛋白,对下游基因Foxo1a、GDF-9和BCL-2基因进行调控,影响颗粒细胞的增殖与凋亡,参与PCOS异常卵泡的发育过程。