人类生殖系统发育是一个动态过程,始于胚胎时期,在青春期出现第二性征并获得生殖能力。整个过程,需要多种基因、蛋白、信号分子以及内分泌激素,进行复杂而精确地配合才能完成。任何影响和阻碍这个进程的因素都可能导致性腺发育异常、外生殖器模糊和生殖能力下降,造成多种疾病状态。性分化异常疾病(DSD)是临床疑难杂症之一。其中46,XY DSD病情尤为复杂,对其诊断和治疗一直是难点。本文第一部分,应用目标序列捕获测序技术检测46,XY DSD患者的致病基因,尝试对疾病进行准确、高效的基因学诊断。本研究同时分析患者基因型与表型相关性,为揭示深层次的发病机制以及性别决定／分化的生理过程提供线索和依据,并指导临床诊治。先天性低促性腺激素性性腺功能减退症(CHH)是导致青春发育延迟生殖能力下降的常见病因。由于发病率低,对其生精治疗的预后影响因素缺乏大样本研究数据。本文第二部分,分析大样本量CHH患者应用促性腺激素治疗的生精疗效及其预测因素,为此病生精治疗的疗效提供循证医学证据,提升临床诊治水平。第一部分：应用目标序列捕获测序技术筛查46,XY性分化异常疾病的致病基因[背景]正常情况下,染色体核型为46,XY的人类胚胎在孕第4-5周时形成具有双向潜能的尿生殖嵴；胚胎发育第7-8周,原始性腺向睾丸分化,Sertoli细胞和Leydig细胞相继发育并分别分泌抗Mullerian管因子(AMH)和睾酮、胰岛素样因子3 (INSL3)。睾酮和AMH共同导致Mullerian管结构退化,促进Wolffian管发育为附睾、输精管、精囊；INSL3则促进睾丸的下降。睾酮通过5a还原酶转化为双氢睾酮,二者均作用于雄激素受体进而产生一系列生物学效应。任何影响了睾丸分化、睾酮合成或作用的因素,都可以导致46,XY性分化异常疾病(Disorders of sex development, DSD)的形成。46, XY DSD是指染色体核型为46,XY,但雄激素合成或作用缺陷,导致外生殖器模糊不清或呈女性外生殖器的一类先天性疾病。该疾病的遗传背景复杂,涉及基因广泛,临床医生了解较少。目前已明确与46, XY DSD致病有关的基因至少有30种。不同致病基因导致的46,XY DSD可有不同的伴随症状,严重程度不一,相应的治疗方式有所不同。即使是相同的基因突变,外生殖器的表型也可呈现很大差异。所以尽早明确分子诊断对于临床诊治、了解疾病预后及产前咨询至关重要。既往针对多个基因进行传统的Sanger测序,往往耗时费力,成本高效率低。近些年快速发展的目标序列捕获测序技术具有针对性强、费用低、效率高等特点。采用目标序列捕获测序对·46, XY DSD患者进行遗传学研究,可快速明确其分子诊断并提高突变的总体检出率。进一步分析和总结不同致病基因导致的46, XY DSD患者的临床特点,建立46, XY DSD患者资料库,可增加对本病发病机制的认识,提高临床诊治水平。[口的]1.总结46, XY DSD患者的临床特点。2.筛查和检测46, XY DSD患者的致病基因。3.分析46, XY DSD患者基因型与表型相关性。[对象和方法]1.研究对象：2014年3月至2015年10月就诊于北京协和医院的63例46, XY DSD患者(除外孤立性阴茎头型尿道下裂、孤立性小阴茎、孤立性隐睾)。2.研究方法：(1)临床研究：收集46, XY DSD患者临床资料,总结其临床特点。(2)基因研究：采用目标序列捕获结合二代测序的方法检测46, XY DSD患者的性腺分化和发育相关的299个基因。将检出的可疑致病突变(Sanger测序验证后)与已知数据库进行比对,并利用SIFT、Polyphen-2和Mutation taster软件对新发突变位点进行功能预测。(3)表型和基因型相关性研究：总结不同基因突变导致的46, XY DSD患者的临床特点,探讨表型与基因型的相关性。[结果]1.本研究共纳入63例46, XY DSD患者,其中49/63(78%)例社会性别为女性,12/63例(19%)有类似疾病家族史。青春启动前就诊的患者(n=34)中24/34(71%)例按社会性别女性抚养,其中12例因外生殖器畸形就诊,12例因阴唇或腹股沟包块就诊；10/34(29%)例患者以社会性别男性抚养,均以外生殖器畸形为主诉就诊。青春启动后就诊的患者(n=29)中25/29(86%)例按照社会性别女性抚养,其中19例因原发性闭经就诊,5例因青春期雄性化就诊,1例因身材矮小筛查染色体发现与表型性别不符就诊；4/29(14%)例患者按照社会性别男性抚养,其中2例以外生殖器畸形就诊,2例以男性乳房发育为主诉就诊。影像学检查提示50/63(79%)例患者存在睾丸或睾丸样组织,14/59(24%)例患者有子宫。明确为46, XY DSD后,青春启动前就诊的患者性别转换率(由社会性别女性转换为男性或反之)为8/24(33%)；青春启动后就诊患者性别转换率为2/25(8%)。2.研究中有48例患者检出致病基因突变,检出率为76%(48/63)；共检出8种致病基因的48处突变位点,有30处为新发突变。其中16(16/63,25%)例检测出AR基因突变；10(10/63,16%)例检测出SRD5A2基因突变；13(13/63,21%)例检测出1VR5A1基因突变；3(3/63,5%)例存在.HSD17B3基因突变；3(3/63,5%)例存在SRY基因突变；1(1/63,2%)例MAP3K1基因突变；1(1/63,2%)例POR基因突变；1(1/63,2%)例CYP17A1基因突变。3.AR、SRD5A2和NR5A1三种基因突变导致146,XY DSD的患者有39例,比例高达62%(39/63)。AR基因突变组与SRD5A2基因突变组患者血睾酮水平(青春期前测定HCG兴奋后水平)无显著性差异(P=0.976),但均明显高于NR5A1基因突变组(P值分别为<0.001,=0.022)。前2组患者均可触及腹股沟或阴唇包块/阴囊内睾丸,均未见子宫；NR5A1基因突变组仅54%(7/13)可触及腹股沟或阴唇包块/阴囊内睾丸,38%(5/13)的患者可见子宫。有6例AR基因突变患者经历了青春期,均有乳房发育,有1例同时有雄性化表现,LH平均为(10.8±3.2)IU/L,FSH(7.0±6.7)IU/L;4例SRD5A2基因突变患者经历青春期,均无乳房发育,其中2例有雄性化表现,LH(12.6±4.1)IU/L,FSH(15.1±8.9)IU/L;NR5A1基因突变患者中有8例经历青春期,3例有乳房发育,3例出现雄性化表现,LH(50.4±45.6)IU/L,FSH(38.9±27.1) IU/L。[结论]1.对于社会性别为女性的46,XY DSD患者,青春期前就诊者多以腹股沟／阴唇包块或外生殖器畸形为主诉；青春期后就诊者多以雄性化或原发性闭经为主诉。社会性别男性患者多以外生殖器畸形或青春期乳房发育就诊。2.本研究中,76%的46,XY DSD患者检测出8种致病基因突变,48处突变位点,其中30处为新发突变。与既往研究相比,目标序列捕获测序技术可明显提高致病基因突变检出率,是鉴定46,XY DSD致病基因的有效方法。3.本研究中,46,XY DSD患者以AR、SRD5A2、NR5A1基因突变最为常见。其中AR、SRD5A2基因突变导致雄激素作用缺陷,是临床常见病因；但也要警惕引起雄激素合成缺陷的NR5A1基因突变。4.AR基因突变组与SRD5A2基因突变组患者均存在睾丸或睾丸样组织,无子宫,血睾酮水平明显高于NR5A1基因突变组。经历青春期的AR基因突变患者均有乳房发育,SRD5A2基因突变患者无乳房发育但出现雄性化的比例较高,NR5A1基因突变患者促性腺激素水平明显升高。这为46,XY DSD患者的临床诊断、鉴别诊断、性别选择及后续治疗,提供了重要的证据。第二部分应用促性腺激素治疗先天性低促性腺激素性性腺功能减退(CHH)患者的生精疗效及影响因素分析[背景]先天性低促性腺激素性性腺功能减退症(Congenital Hypogonadotropic Hypogonadism, CHH),是由于下丘脑GnRH分泌或作用缺陷而导致的一类疾病。GnRH缺乏,导致垂体分泌促性腺激素不足,进而引起睾丸产生雄激素不足和生精障碍。根据是否合并存在嗅觉障碍,该类疾病可分为有嗅觉障碍的Kallmann综合征和嗅觉正常的CHH (normosmic Congenital Hypogonadotropic Hypogonadism, nCHH)。 CHH的总发病率约为1/8,000-10,000,男女比例约5：1。对于有生育需求的男性患者,促性腺激素治疗有助于促进睾丸发育、睾酮合成和精子生成。CHH发病率较低,因此关于其生精疗效的研究,国内外缺乏大样本研究数据。目前,不同研究对促性腺激素生精疗效及影响因素的研究结论尚不完全一致。本研究共纳入应用绒促性腺激素(human chorionic gonadotropin, HCG)联合尿促性腺激素(human menopausal gonadotropin, HMG)促进生精治疗的223例男性CHH患者。研究旨在通过大样本分析促性腺激素生精治疗CHH患者的疗效及其影响因素,为临床开展生精治疗提供更多循证医学证据。[目的]1.分析CHH患者应用HCG联合HMG生精治疗的疗效,并寻找影响CHH患者精子产生的预测指标。2.分析伴隐睾的CHH患者应用HCG联合HMG生精治疗的疗效。[对象和方法]1.研究对象：2005年1月至2014年12月就诊于北京协和医院的男性CHH患者223例(其中伴有隐睾者40例)。2.研究方法：回顾性分析。3.治疗及随诊方案：所有患者给予HCG (2000-5000U,肌肉注射,每周2次)联合HMG (75-150U,肌肉注射,每周2次)治疗至少6个月。每3-6个月随诊1次,测定性激素水平、睾丸体积变化、精子生成情况,记录患者妻子妊娠和生育情况。[结果]1.CHH患者(n=223)平均随诊时间为23±13个月。患者初诊时的睾酮(0.9±0.5)nmol/1,睾丸体积(取两侧体积的平均值)(2.1±1.6)ml。治疗后末次随诊睾酮(15.1±8.2)nmol/1(和治疗前相比明显升高,P<0.001)；末次随诊时,睾丸体积(8.1±4.6)ml(和治疗前相比,睾丸体积明显增大,P<0.001)。所有患者预测的精子初现中位治疗时间为15个月[95%可信区间(confidence interval, CI) 13.5-16.5]。患者初诊时睾丸体积大(P=0.012)、无隐睾史(P=0.028),是精子初现时间缩短的重要影响因子。共143例(143/223,64%)患者成功产生精子,平均精子初现时间为(14±8)个月。基础睾丸体积(p=-1.074,P=0.003)、隐睾史(p=3.457,P=0.004)、开始生精治疗年龄(p=-0.445,P=0.002)是影响精子初现时间的重要预测因素。有精子生成的患者中,34例患者有生育需求,有19/34例(56%)患者的配偶共妊娠20次。2.40例伴有隐睾的CHH患者平均随诊24(15,33)个月,预测的精子初现中位时间为24个月(95%CI 17.8-30.2)。其中20例(20/40,50%)患者成功生成精子,9例已婚且有生育需求的患者中有5例(5/9,56%)成功孕育下一代。3.与不伴隐睾的CHH患者相比,隐睾患者精子初现中位治疗时间更长(24个月 vs.15个月,P<0.001),生精成功率更低(50% vs.67%,P=0.032),生精成功者的末次随诊平均精子密度更低[1.9(0.5,8.6)百万/nl vs.11.1(1.0,25.0)百万/ml,P=0.006]。[结论]1.促性腺激素可有效促进CHH患者精子生成。基础睾丸体积和隐睾史是影响生精成功治疗时间的主要因素。2.尽管隐睾史是生精治疗的不利因素,伴隐睾的CHH患者经过促性腺激素治疗后仍有一半可成功生成精子。虽然生精时间明显延长,精子密度较低,但其配偶仍然存在受孕的机会。