【摘 要】
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脑出血（Intracerebral hemorrhage,ICH）因具有高致死率和致残率的特点,对家庭和社会造成极大的负担,但临床尚无有效的治疗方法,开发ICH治疗新策略对提高患者预后具有重要意义。血肿是诱发ICH后脑损伤的核心因素,既可因占位效应造成原发性脑损伤,又能由于血肿降解诱导继发性脑损伤。ICH后促进血肿吸收治疗对于缓解脑损伤具有重要作用,但研究发现诱导脑内小胶质细胞/巨噬细胞吞噬作用的
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脑出血（Intracerebral hemorrhage,ICH）因具有高致死率和致残率的特点,对家庭和社会造成极大的负担,但临床尚无有效的治疗方法,开发ICH治疗新策略对提高患者预后具有重要意义。血肿是诱发ICH后脑损伤的核心因素,既可因占位效应造成原发性脑损伤,又能由于血肿降解诱导继发性脑损伤。ICH后促进血肿吸收治疗对于缓解脑损伤具有重要作用,但研究发现诱导脑内小胶质细胞/巨噬细胞吞噬作用的CD163也会在神经元高表达,造成神经元的凋亡。因此,如何在促进血肿内源性吸收的同时特异性保护神经元是ICH治疗的关键。基于上述问题,本论文设计构建了兼具血肿靶向、ROS敏感释药及神经元特异保护的角蛋白纳米粒,在ICH后促进血肿吸收的同时保护神经元。通过角蛋白融合FBD和接枝NBC构建具有血肿靶向和ROS敏感的药物载体,借助在病灶区域靶向释放蓓萨罗丁促进小胶质细胞/巨噬细胞CD163高表达以提高内源性血肿吸收,并且利用神经元靶向肽C3肽与s CD163融合蛋白阻止神经元内吞血红蛋白的诱骗受体以实现特异保护神经元。本文主要研究内容和结论如下:（1）构建了载Bex和s CD163-Fc-C3的ROS敏感型FBD-角蛋白纳米粒。设计了FBD-s K37-2α和s CD163-Fc-C3重组蛋白,通过大肠杆菌表达获得了纯度和浓度均较高的重组蛋白,SDS-PAGE结果显示分子量分别集中在27 k D和138 k D。进而利用NBC的酯基与FBD-s K37-2α的氨基反应合成具有ROS敏感的两亲性FBD-s K37-2α-NBC（FKN）,进一步通过自组装制备FBD-s K37-2α纳米粒并利用氢键、疏水相互作用和阳离子-π作用实现Bex和s CD163-Fc-C3两种药物的装载。TEM观察纳米粒具有类球形结构,分散性良好,粒径约为43.63 nm。Zeta电位测定发现载药FBD-s K37-2α-NBC（FKNBs）的电位为-16.6±1.15 m V,且粒径分析也与TEM观察到的结果一致。最后借助~1H-NMR和FT-IR的表征证明了NBC、FKN及FKNBs的成功合成。（2）体外表征了纳米粒的活性氧敏感释药行为、靶向性及安全性。首先,载药率及包封率测定结果表明FKNBs对Bex的载药率及包封率分别为19.65±1.22%和81.60±6.32%,对s CD163-Fc-C3的载药率及包封率分别为14.87±0.51%和87.34±3.54%。其次,利用不同浓度H2O2模拟体内微环境考察药物ROS敏感释放行为,在含0.1 m M H2O2的释放介质中Bex即呈现敏感释药行为,72 h内释放率可达77.91±6.15%（约为0 m M H2O2的1.83倍）;s CD163-Fc-C3 48 h内累积释放度可达约63%（约为0 m M H2O2的4.2倍）。再次,通过FITC标记的s CD163-Fc-C3与小鼠海马神经元细胞系共孵育实验表明s CD163-Fc-C3能够靶向HT22,且靶向作用呈现出时间依赖性,在24 h基本达到平衡。通过CCK-8法考察了FKNBs的细胞毒性,测定发现FKNBs未对HT22细胞产生毒性且出现促进增殖作用。（3）完成了纳米粒体内治疗ICH的效果评价。体内靶向实验结果表明FKNBs能够靶向血肿,且释放出的FITC-s CD163-Fc-C3具有神经元靶向性,12 h时神经元处仍有药物滞留。通过建立不同治疗分组,探究治疗差异:对血肿体积分析发现,第7天ICH+Vehicle组、ICH+FKNBs组、ICH+Bex-FKN组及ICH+Bex组的血肿体积分别为3.39±0.66、0.03±0.02、0.97±0.04和1.18±0.10 mm~3,与ICH+Vehicle组对比,治疗组结果均具有显著性差异,表明Bex确具有促进血肿吸收的作用。同时,各组CD163的表达与血肿体积测定结果一致,证明Bex具有显著促进CD163表达的作用（*p＜0.05）。进而利用TUNEL染色分析证实了FKNBs具有显著减轻神经元凋亡的功能（*p＜0.05）。在神经行为学评价实验中,FKNBs表现出促进神经功能恢复的作用,减轻了因神经功能缺损导致的肢体障碍。体重、脏器系数和H＆E染色分析表明FKNBs不会在动物体内引发急性毒性反应,具有良好的组织生物相容性。综上所述,本论文制备的FKNBs具有血肿靶向、ROS敏感释药和神经元特异保护的功能,在动物体内ICH后促进血肿内源性吸收的同时,可有效保护神经元,进而缓解ICH诱发的脑损伤。本论文的完成不仅可为脑出血的治疗提供新选择,还为脑出血治疗功能载体的设计构建提供理论和实验基础。
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