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骨关节炎(Osteoarthritis,OA)是临床常见的关节系统慢性炎性疾病。关节腔炎性微环境在OA发生和发展中扮演重要角色,前期临床样本研究提示多效性巨噬细胞迁移抑制因子(Macrophage migration inhibitory factory,MIF)与OA的发生和发展密切相关,但MIF在关节腔中的作用与机制并不明确。因此,论文从不同KL分级OA患者关节滑液中炎性细胞因子的表达特性出发,就MIF对OA患者软骨细胞衰老和凋亡的调控机制进行了前期探索性研究,以期为OA发生和发展机理以及相关药物开发提供参考依据。主要研究内容与结果:1、采用细胞因子阵列实验对KL-0~KL-4级OA患者关节滑液中的细胞因子表达特性进行了探讨。结果显示:重度OA患者关节滑液中MIF表达量明显增强。进一步采用人类MIF ELISA试剂盒定量分析MIF表达水平,得到OA患者MIF平均浓度表达水平介于40~238 ng/m L之间。结果显示:MIF表达量与OA KL分级并无等级相关性。2、OA患者软骨细胞体外培养体系建立与分泌表型鉴定。提取OA软骨细胞后,分别考察了不同换液频率和不同FBS浓度对OA软骨细胞形态、均一化程度、细胞密度、碎屑与死细胞以及剩余营养物质的影响。结果显示:对于至少含10%FBS的DMEM高糖培养基,采用3天换液一次可使细胞状态良好。采用阿尔新蓝染色法、甲苯胺蓝染色法和特异性蛋白免疫荧光染色对OA软骨细胞的特异性分泌蛋白进行鉴定。结果表明:P1代OA软骨细胞可大量分泌蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白(Type II collagen,COL II),分泌表型良好。3、MIF对OA软骨细胞衰老和凋亡表型的调控机制探讨。(1)采用CCK-8法研究不同浓度MIF(5~200 ng/m L)对OA软骨细胞增殖活力影响。结果显示:不同浓度MIF对OA软骨细胞体外增殖活性影响并无显著性差异(P>0.05)。(2)通过LPS诱导OA软骨细胞模拟炎性损伤并采用Annexin V-FITC/PI染色法和Western Blot法检测不同浓度MIF对OA软骨细胞凋亡比率以及凋亡标记蛋白Caspase3表达水平。Annexin V-FITC/PI染色结果显示:各组总凋亡比例介于17.57%~45.97%,与LPS组相比,LPS+MIF50组和LPS+MIF200组的OA软骨细胞具有较高的凋亡率。Western Blot结果显示:与LPS组相比,LPS+MIF50组和LPS+MIF200组上调Caspase3的表达水平,但LPS+MIF200组上调Caspase3表达更为显著,即高浓度MIF可促进Caspase3的表达。(3)采用SA-β-gal染色、免疫荧光染色、RT-q PCR和Western Blot等方法,分别检测不同浓度MIF对LPS诱导的OA软骨细胞中衰老标记物SA-β-gal、衰老标记蛋白p16和p53的表达水平。SA-β-gal染色结果显示:与对照组相比,MIF50组和MIF200组的SA-β-gal阳性细胞数量相当;与LPS组相比,对照组、LPS+MIF50组和LPS+MIF200组OA软骨细胞中的SA-β-gal阳性细胞均较少。Western Blot结果显示:与LPS组相比,LPS+MIF50组的p16蛋白表达相当,而LPS+MIF200组的p16蛋白表达水平显著降低(P<0.05),即高浓度MIF可抑制p16的表达。同时,与LPS组相比,LPS+MIF50组与LPS+MIF200组的p53表达水平显著降低(P<0.05),LPS+MIF200组较LPS+MIF50组的p53表达水平更低,即高浓度MIF可抑制p53的表达。免疫荧光染色实验结果显示:与LPS组相比,LPS+MIF50组和LPS+MIF200组的p16表达水平下调。(4)采用Western Blot、RT-q PCR和免疫荧光染色法检测对表型蛋白COL II基因和蛋白水平、SOX9和MMP13的蛋白水平。Western Blot实验结果表明:与LPS组相比,LPS+MIF50组的COLⅡ表达水平较高,LPS+MIF200组的SOX9的表达水平较LPS组更高;LPS+MIF50组和LPS+MIF200组的MMP13水平较高。RT-q PCR结果和免疫荧光染色结果均表明:与LPS组相比,LPS+MIF50组的COL IIa1基因和COLⅡ蛋白表达水平更高,LPS+MIF200组上调COL IIa1基因和COLⅡ蛋白表达水平,但效果不及LPS+MIF50组。综上所述:高浓度MIF通过促进Caspase3表达,抑制p16和p53表达,更有利于OA软骨细胞自我清除受损细胞改善衰老表型;低浓度MIF更有利于OA软骨细胞促进SOX9和COLⅡ的表达,抵抗炎性微环境的胁迫,也有益于延缓OA的进展。因此,MIF在关节腔中可能通过影响软骨细胞凋亡和衰老发挥对关节软骨的保护作用。