【摘 要】
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麦角甾醇（ergosterol）又被称为麦角固醇,是合成维生素D2的前体物质,在医药、食品、以及饲料行业应用广泛。由于我国研究麦角甾醇时间较迟,需求量较大,往往供不应求。目前我国生产麦角甾醇的主要方法是利用微生物发酵生产,利用的主要菌种通常是酵母菌、大型真菌以及霉菌等,优点是繁殖快,易培养,产量大,安全快捷,但菌种间麦角甾醇含量差异较大是普遍存在的问题。因此提高微生物源的麦角甾醇含量是亟待解决的问
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麦角甾醇（ergosterol）又被称为麦角固醇,是合成维生素D2的前体物质,在医药、食品、以及饲料行业应用广泛。由于我国研究麦角甾醇时间较迟,需求量较大,往往供不应求。目前我国生产麦角甾醇的主要方法是利用微生物发酵生产,利用的主要菌种通常是酵母菌、大型真菌以及霉菌等,优点是繁殖快,易培养,产量大,安全快捷,但菌种间麦角甾醇含量差异较大是普遍存在的问题。因此提高微生物源的麦角甾醇含量是亟待解决的问题。本论文通过微生物生理生化以及分子生物学技术研究酵母菌中麦角甾醇含量的变化。主要研究结果如下:（1）通过葡萄果皮上分离纯化出20株形态特征与酵母相似的菌落,分别对20株酵母中麦角甾醇的含量进行检测,最终得到一株麦角甾醇含量较高的酵母菌株,编号为SC19。利用ITS基因的PCR以及测序确定SC19为酵母种酿酒酵母属,该菌麦角甾醇含量为4.51%。利用高效液相色谱法（HPLC）,验证麦角甾醇最优吸光值为281 nm。考虑成本以及耗时等问题,最终选择检测方法较为快捷简单的UV法进行麦角甾醇的含量检测。（2）利用皂化提取法对SC19中麦角甾醇进行提取及含量检测,当发酵至72 h时酵母菌中麦角甾醇的含量达到最高,为4.51%。分别对皂化提取法中KOH浓度（A）、萃取溶剂乙醚体积（B）、皂化温度（C）以及皂化时间（D）进行四因素三水平正交试验。利用SPASS软件进行方差分析,得出最优组合为A2B3C2D1,即KOH浓度为50%,乙醚体积为15 m L,皂化温度为80℃,皂化时间为1 h。经优化后酵母SC19中麦角甾醇含量达到5.46%。（3）通过研究培养基中不同成分对酵母SC19中麦角甾醇的含量以及生长情况的影响,得出如下结果:果糖在作为碳源时麦角甾醇含量达到最高,此时麦角甾醇含量达到6.86%;硝酸铵作为氮源时,SC19生长情况较好且麦角甾醇含量高达5.52%;当KH2PO4浓度为0.1%和0.2%时SC19生长情况最好,此时麦角甾醇的含量分别为4.05%和3.94%;硫酸镁作为金属离子时不仅有助于菌体的生长,同时麦角甾醇含量远高于其他金属离子,达到5.66%。基于上述结果,选择果糖（A）、硝酸铵（B）、硫酸镁（C）、磷酸氢二钾（D）为培养基成分。利用SPASS设计四因素三水平试验,得出最佳培养基组合为A1B3C3D3,即果糖0.5%,硝酸铵为3%,硫酸镁为0.4%,磷酸氢二钾为0.2%。经优化后酵母SC19中麦角甾醇含量达到6.71%。（4）利用Snapgene软件设计特异性引物,通过PCR技术从酵母SC19中成功克隆出erg1基因。成功构建克隆质粒p MD-18T-erg1以及表达质粒p YES2-erg1,转入INVSC1酵母,并通过Western blot验证erg1基因成功在酵母中过表达,成功构建erg1过表达工程菌株YIS7。（5）利用优化后的皂化提取方法以及培养基成分,研究酵母SC19、INVSC1以及工程菌株YIS7的生长情况以及麦角甾醇的含量,得出结果如下:工程菌株YIS7中麦角甾醇含量为4.81%,比原始酵母INVSC1提高了0.90%。说明erg1基因的过表达对酵母产麦角甾醇有一定促进作用。
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