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目的根据最新的Cancer Statistics报道,在女性中,乳腺癌的发病率排名第一,死亡率排名第二。虽然乳腺癌患者5年生存率随着乳腺癌筛查的普及有所提升;但是现今针对复发及转移乳腺癌患者仍缺乏有效的治疗手段。抑癌基因在乳腺癌的发生发展中发挥重要作用,寻找新的抑癌基因并进一步深入研究其分子机制,将有助于为预后的预测和综合治疗提供新的生物标志物。肿瘤中,抑癌基因常位于染色体杂合性缺失区域（Loss of heterozygosity,LOH）,其表达常由于启动子的Cp G岛发生甲基化而降低甚至沉默。为了在乳腺癌中发现新的潜在的抑癌基因,我们收集了乳腺癌组织及正常乳腺组织并对其采用了转录组测序技术（RNA sequencing,RNA-seq）进行检测及分析,选择了一个潜在的抑癌基因（Tumor suppressor gene,TSG）。联合数据库分析了信使核糖核酸（Messenger ribonucleic acid,mRNA）表达及其启动子甲基化状态后,进一步对该基因在乳腺癌中的表达、启动子甲基化状态以及具体的生物学功能和可能的分子机制进行探索。本研究将有助于揭示选定的TSG在乳腺癌中可能的分子机制,有望为潜在的乳腺癌生物标志物提供实验基础。方法1将收集到的乳腺癌组织和正常乳腺组织送RNA-seq进行检测后分析转录水平基因表达差异。在差异显著的前30个基因中,选择D2型多巴胺受体（Dopamine Receptor D2,DRD2）进行进一步研究。运用了在线Meth HC数据库分析了DRD2在乳腺癌组织及正常乳腺组织中的mRNA表达及启动子甲基化状态;使用了TCGA在线数据库探索DRD2在正常乳腺组织及乳腺癌组织中的mRNA的表达及启动子甲基化状态;利用了免疫组化（Immunohistochemistry,IHC）检测DRD2在正常乳腺组织及乳腺癌组织中蛋白水平的表达情况;采用了kmplot数据库用于探索乳腺癌组织中DRD2的表达高低对不同分型乳腺癌患者生存时间的影响;进一步分析了癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）数据库,对乳腺癌组织中的DRD2表达高低及启动子甲基化状态与乳腺癌患者的临床病例特征的相关性进行探索。2在人的乳腺癌细胞系及正常永生化上皮细胞系中使用逆转录聚合酶链式反应（Reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR）检测DRD2的mRNA表达水平,并进一步采用甲基化特异性聚合链式反应（Methylation specific PCR,MSP）检测DRD2启动子甲基化状态;为了进一步确认乳腺癌细胞系中DRD2的表达缺失或降低是否可能受到甲基化调控,在DRD2表达缺失的MDA-MB231和BT549细胞中使用去甲基化药物后,q RT-PCR进一步检测DRD2的mRNA表达。3在DRD2表达沉默的人乳腺癌细胞系MDA-MB231和BT549中构建了稳定表达DRD2的细胞株。对DRD2在体外对乳腺癌细胞的生物学功能的影响采用了以下实验进行了检测:采用细胞计数试剂盒（Cell Counting Kit-8,CCK8）细胞增殖实验,细胞克隆形成实验,软琼脂形成实验用于检测DRD2的过表达对乳腺癌细胞生长的作用;流式细胞术（Flow cytometer,FCM）和吖啶橙/溴乙啶（Acridine orange/Ethidium bromide,AO/EB）实验分别进一步研究了DRD2的过表达对乳腺癌细胞周期以及凋亡的影响;划痕实验,迁移及侵袭实验检测了DRD2对乳腺癌细胞转移能力的作用;在小鼠乳腺癌细胞系4T1中构建了稳定表达DRD2的细胞株后,进一步构建了小鼠皮下成瘤模型,对DRD2的过表达在体内对乳腺癌的发生发展的影响进行了研究。使用了Transwell?构建了乳腺癌细胞-巨噬细胞共培养体系,研究了在乳腺癌细胞中过表达DRD2对乳腺癌相关巨噬细胞的作用,以及乳腺癌相关巨噬细胞对表达DRD2的乳腺癌细胞的作用。4蛋白免疫印迹法（Western Blot,WB）,免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation,Co-IP）,Antibody Array细胞因子芯片,质谱,实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,q RT-PCR）,苏木精-伊红染色（Hematoxylin and Eosin,HE）,免疫荧光（Immunofluorescence,IF）以及IHC被进一步用于DRD2对乳腺癌发生发展的机制研究。结果1 DRD2的mRNA和蛋白在乳腺癌中的表达低于正常组织;与此同时,在乳腺癌中,DRD2的启动子处于高甲基化状态;在DRD2表达缺失的乳腺癌细胞系中使用去甲基化药物5-氮杂-2脱氧胞苷（5-aza-2-deoxycytidine,Aza）后,DRD2的mRNA表达恢复。2在体外实验中,过表达的DRD2抑制乳腺癌细胞生长和转移,并将细胞周期阻滞在G2/M期;同时,过表达DRD2显著抑制乳腺癌细胞的上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）;DRD2的过表达在体内外均促进乳腺癌发生凋亡（Apoptosis）;同时,DRD2也促进了乳腺癌细胞的坏死性凋亡（Necroptosis）。体内实验中,DRD2也同样发挥抑制乳腺癌生长的作用。3在乳腺癌细胞与巨噬细胞的相互作用的过程中,DRD2重塑乳腺癌相关巨噬细胞使其向M1型分化;而巨噬细胞诱导了乳腺癌细胞发生由GSDME执行的焦亡,并且焦亡的发生是依赖于乳腺癌细胞中DRD2的表达。4 DRD2高表达在HER2-患者中更常见,且DRD2高表达延长了HER2+患者的生存时间。DRD2的过表达抑制了乳腺癌细胞中EGFR和HER2的mRNA表达水平,且DRD2蛋白与EGFR结合。5 DRD2在非选择性配体LPS或巨噬细胞的刺激下可以被激活并发生内吞;在这过程中,DRD2与β-arrestin2结合并激活β-arrestin2,β-arrestin2与TAK1竞争性结合TAB1,进而阻碍了NF-κB信号通路上游的TAK1活化,抑制了NF-κB中p65的磷酸化以及入核;同时,静息状态的DRD2可以结合并下调DDX5和eEF1A2的表达,从而抑制乳腺癌细胞的增殖和迁移能力,以及拮抗NF-κB信号通路的激活。结论在乳腺癌细胞和乳腺癌组织中,DRD2由于启动子发生了甲基化而表达缺失或降低。在乳腺癌中,DRD2发挥抑癌的作用,重塑乳腺癌相关巨噬细胞的极性。一方面,DRD2通过与β-arrestin2和DDX5以及eEF1A2相互作用限制了NF-κB信号通路的激活;另一方面,巨噬细胞诱导了乳腺癌细胞发生GSDME执行的焦亡,且焦亡的发生依赖于乳腺癌细胞DRD2的表达。