甲基苯丙胺(methamphetamine,METH)俗称“冰毒”,是世界范围内滥用最为广泛、蔓延最为迅速的毒品。它属于苯丙胺类精神兴奋剂,主要作用于中枢神经系统,使人产生欣快感、兴奋、甚至产生幻觉,因此多次使用后导致成瘾。长期滥用可导致神经毒性,引起脑结构和功能的改变。脑组织病理改变包括单胺能神经末梢损伤、脑灰质萎缩、白质增生和胶质细胞活化。脑功能改变包括出现幻觉、妄想/攻击行为、人格瓦解和以记忆、注意和执行力下降为主要表现的认知功能损害。METH神经毒性的机制主要包括高热、单胺类递质过度释放、氧化应激、线粒体功能障碍和炎症反应等。近年来,METH导致血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)损伤的作用研究越来越广泛。大量动物水平研究表明METH单次高剂量和低剂量长时间暴露导致BBB通透性增加和结构的短暂变化。BBB通透性增加表现为内源性免疫球蛋白和大分子物质渗漏增加,以海马和杏仁核最明显,早期主要与高温有关。BBB结构改变表现为紧密连接蛋白如occludin,claudin-5和闭合小环蛋白(zonula occludens,ZO-1)表达减少,可能与基质金属蛋白酶-9增加有关。目前认为METH诱导BBB损伤与氧化应激机制有关。脑微血管内皮细胞是BBB的主要成分。METH作用于脑微血管内皮细胞可引起活性氧(reactive oxygen species,ROS)增加,破坏紧密连接蛋白和跨上皮细胞间电阻,增加小分子物质的渗漏。内质网是真核细胞的重要细胞器,具有蛋白质合成、折叠、修饰和转运等功能。细胞受到外界刺激,大量未折叠/错误折叠蛋白在内质网蓄积,引发一系列应激反应,称为内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)。内质网膜上有3种跨膜信号蛋白,包括RNA依赖的蛋白激酶样内质网激酶(protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)、肌醇需求酶1(inositol-requiring enzyme-1,IRE1)、激活转录因子6(activating transcription factor 6,ATF6)。在生理状态下,3种蛋白的内质网腔内结构域与分子伴侣GRP78/BIP(glucose-regulated protein 78,GRP78;immuno-globulin heavy chain binding protein,BIP)结合,处于无活性状态。当内质网腔内有大量未折叠蛋白/错误折叠蛋白蓄积时,3种蛋白与GRP78/BIP分离,处于活化状态,启动ERS。在ERS早期,分离GRP78/BIP与未折叠/错误折叠蛋白结合,促进蛋白的正确折叠,是适应机制。持续ERS激活C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)和caspase12通路,诱发细胞凋亡。氧化应激和ERS是相互联系的,细胞内外环境发生变化时二者常同时存在。氧化应激促进ERS,激活凋亡信号通路;持续的ERS诱发氧化应激。例如,在神经元中ROS释放可激活CHOP;在维生素B缺乏引起的神经退行性变中,氧化应激可破坏ER的氧化/还原状态,导致内质网内错误蛋白质折叠,诱导ROS的产生。但是METH破坏BBB是否与内质网应激有关,METH破坏BBB机制是否存在ERS与氧化应激的相互作用,目前尚无相关报道。基于以上研究背景,本研究拟在动物整体水平,明确METH对动物BBB结构和功能的损伤作用及内质网应激是否参与其中。通过细胞水平的观察,明确METH对b End.3细胞(小鼠脑微血管内皮细胞系)的损伤作用;通过观察METH处理b End.3细胞后ERS相关蛋白的变化,阐明ERS在METH引起b End.3细胞损伤中的作用和信号机制;并观察METH处理b End.3细胞后氧化应激相关指标变化,明确氧化应激和内质网应激交互关系在METH引起b End.3细胞损伤中的作用。通过上述研究为METH神经毒性机制提供的新的理论依据。第一部分内质网应激在METH诱导的小鼠血脑屏障损伤中的作用目的:在动物水平明确内质网应激在METH所诱导小鼠BBB损伤中的作用。包括通过METH急性处理诱导的小鼠体温变化和刻板行为,评价METH对小鼠的神经毒性;采用荧光素钠和伊文思蓝渗漏实验及检测脑组织中紧密连接蛋白的表达,评价METH对小鼠BBB结构和功能的损伤;通过METH给予前腹腔注射ERS抑制剂4-苯基丁酸(4-phenylbutyric acid,PBA),评价PBA对METH诱导的小鼠BBB结构和功能损伤的影响。方法:1小鼠METH急性作用模型建立及观察指标。C57BL/6小鼠,METH5 mg/kg,腹腔注射,于8:00-20:00重复给药4次,间隔3 h。然后于第一次注射前30 min、每次药物注射后1 h及第一次药物注射后24 h观察METH诱导的肛温变化;并参考Sams-Dodd’s评分标准评价刻板行为,明确METH对小鼠的神经毒性,判断模型建立是否成功。2 METH诱导的小鼠BBB损伤检测。通过测定METH作用后脑组织中荧光素钠和伊文思蓝量,观察BBB的通透性的变化。于第一次药物注射后24 h,腹腔注射2%荧光素钠或尾静脉注射2%伊文思蓝,分别于30min和2 h后灌注取脑,测定脑组织中荧光素钠和伊文思蓝量。3脑组织紧密连接蛋白的检测。于第一次METH注射后24 h,取脑,用Western blot法检测脑组织中Claudin 5和Occludin蛋白含量。4 PBA对METH诱导的小鼠BBB损伤的影响。每次METH给予前30min腹腔注射PBA 50mg/kg,于第一次METH注射后24 h,腹腔注射2%荧光素钠或尾静脉注射2%伊文思蓝,分别于30 min和2 h后灌注取脑,测定脑组织中荧光素钠和伊文思蓝量。5 PBA对METH诱导的脑组织紧密连接蛋白变化的影响。每次METH给予前30min腹腔注射PBA 50mg/kg,于第一次METH注射后24 h,取脑,用Western blot法检测脑组织中Claudin 5和Occludin蛋白含量。结果:1 METH(20 mg/kg/d)处理可诱导小鼠产生明显的刻板性动作,如反复转圈和摇头,伴有明显的体温升高(约2℃)。2 METH(20 mg/kg/d)使小鼠脑组织中荧光素钠和伊文思蓝含量明显增加,紧密连接蛋白Claudin 5和Occludin蛋白表达减少。3 PBA(200 mg/kg/d)明显抑制了METH所致小鼠脑组织中荧光素钠和伊文思蓝含量的增加,及紧密连接蛋白Claudin 5和Occludin蛋白表达的减少。小结:METH急性作用,可引起C57BL/6小鼠高温和刻板行为,使血脑屏障的通透性增加、紧密连接破坏。ERS抑制剂PBA可以缓解METH造成的血脑屏障通透性增加和紧密连接破坏,说明内质网应激参与了METH所致小鼠血脑屏障损伤的过程。第二部分METH诱导脑微血管内皮细胞损伤的内质网应激机制研究目的:离体水平评价METH破坏血脑屏障的内质网应激机制。包括通过检测METH对细胞存活率、凋亡率、跨上皮电阻和紧密连接蛋白含量的变化,评价METH对脑微血管内皮细胞的损伤;采用m RNA PCR-array和Western blot的方法检测METH对未折叠蛋白反应信号通路的影响;通过METH处理前给予内质网抑制剂4-苯基丁酸(4-phenylbutyric acid,PBA)和Salubrinal观察其对METH诱导CHOP和pro-caspase12的干预作用;通过小干扰RNA(si RNA)技术敲低CHOP,观察CHOP在METH诱导细胞损伤中的作用。方法:1 METH对脑微血管内皮细胞(b End.3)损伤的检测。首先应用细胞免疫荧光法鉴定b End.3细胞的标志蛋白CD31,然后用MTT观察METH对b End.3细胞生存率抑制的时效和量效关系;应用流式细胞术及TUNEL法分别检测1m M METH处理b End.3细胞24 h、48 h、72 h的凋亡率,以及1m M METH处理b End.3细胞24 h的凋亡率;应用电阻仪检测1m M METH处理b End.3细胞24 h、48 h、72 h后跨上皮电阻(trans-endothelial electrical resistance,TEER)的变化;用Western blot检测细胞中Claudin 5和Occludin蛋白含量的变化。2观察METH对未折叠蛋白反应信号通路的影响。应用PCR-array方法检测1m M METH作用b End.3细胞24 h后未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)信号通路相关84个基因的表达,筛选有明显变化的基因;用Western blot法检测1m M METH作用b End.3细胞0、0.5、1、3、6、12、24 h后GRP78/Bip、p-IRE1α、p-PERK和ATF6蛋白的变化。3观察METH对内质网应激相关蛋白CHOP和pro-caspase12表达的影响。通过Western blot法检测1m M METH作用b End.3细胞0、1、3、6、12、24 h CHOP和pro-caspase12蛋白的变化,并观察内质网抑制剂PBA 50μM和Salubrinal 5 m M对METH诱导CHOP和pro-caspase12的干预作用。4观察CHOP在METH诱导细胞损伤中的作用。在METH处理b End.3细胞前24h应用小干扰RNA(si RNA)技术敲低CHOP,经Western blot验证si RNA敲低效率后,用MTT观察细胞生存率,用流式细胞术和TUNEL检测凋亡率,用电阻仪检测TEER,用Western blot检测紧密连接蛋白Claudin 5和Occludin蛋白含量变化。结果:1激光共聚焦显微镜显示b End.3细胞胞浆及胞膜呈绿色,DAPI标记胞核呈蓝色,b End.3标志蛋白CD31呈强阳性表达,提示b End.3细胞具有内皮细胞表达特性,可用于后续研究。2 1 m M METH作用于b End.3细胞24h,使细胞存活率明显下降。然后观察METH 1 m M作用24h、48h、72h,均使细胞存活率明显下降,凋亡率的明显增加,TEER明显下降、Claudin 5和Occludin蛋白表达明显减少。3 m RNA PCR-array结果显示1m M METH处理b End.3细胞24 h引起未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)中Hspa5(GRP78/Bip)、XBP-1(p-IRE1α下游信号)、ATF6、Ddit3(CHOP)、ATF4(p-PERK下游信号)和e IF2α(p-PERK下游信号)明显增加。Western blot结果示Bip于METH处理3h开始增加,且随着时间的推移逐渐增加;p-IREα于METH处理3h开始明显增加,12h达高峰,然后呈下降趋势;p-PERK于METH处理1h开始增加,6h达高峰,然后呈下降趋势;上述指标增加均持续至24h;而ATF6则从METH处理0.5 h开始增加,3h达高峰,高峰持续至24h。4 Western blot结果示CHOP和pro-caspase12从1m M METH处理12h开始增加持续至24h;内质网抑制剂50μM PBA和5 m M Salubrinal明显抑制METH引起的CHOP和pro-caspase12增加。5 Western blot结果示CHOP si RNA明显抑制了CHOP的表达;MTT结果示CHOP si RNA明显抑制了METH所致的细胞存活率下降;流式细胞术和TUNEL结果示CHOP si RNA明显抑制了METH所致的凋亡率增加,电阻仪和Western blot检测示CHOP si RNA明显抑制了METH所致的TEER下降、Claudin 5和Occludin蛋白表达减少。小结:METH可导致脑微血管内皮细胞生存率下降、凋亡率增加和紧密连接蛋白减少,并且随着时间的延长损伤更严重。METH可使脑微血管内皮细胞内质网应激分子伴侣GRP78/Bip和感受器蛋白p-PERK、p-IRE1α、ATF6持续增加,并引起内质网应激相关凋亡信号CHOP和pro-caspase12的持续增加。抑制内质网应激可部分逆转METH诱导的CHOP和pro-caspase12的增加。CHOP敲低可抑制METH所致的生存率下降、凋亡率增加、TEER下降和紧密连接蛋白减少,提示METH可通过内质网应激机制破坏脑微血管内皮细胞。第三部分内质网应激与氧化应激的交互关系在METH诱导脑微血管内皮细胞损伤中的作用目的:观察METH能否诱导小鼠微血管内皮细胞发生氧化应激,并进一步探讨METH作用小鼠微血管内皮细胞后内质网应激与氧化应激的交互作用。方法:1观察METH对b End.3细胞氧化应激相关信号的影响。1m M METH处理b End.3细胞0、1、3、6、12、24 h,用共聚焦显微镜和荧光分度计定性和定量检测ROS;用Western blot法检测线粒体凋亡相关蛋白Bcl2/Bax;用荧光分度计检测线粒体膜电位变化;用Western blot法检测胞浆和线粒体细胞色素c蛋白;1m M METH处理b End.3细胞24 h,用细胞免疫荧光检测胞浆细胞色素c。2观察活性氧对METH所致b End.3细胞内质网应激相关信号的影响。1m M METH处理前30 min分别给予200μM apocynin(ROS的抑制剂)和100μM N-叔丁基-α-苯基硝酮(N-tert-butyl-α-phenylnitrone,NBP)(ROS的清除剂)后用Western blot法检测内质网应激相关蛋白GRP78/Bip、p-IRE1α、p-PERK和ATF6的表达变化。3观察CHOP敲低对METH所致b End.3细胞细胞色素c从线粒体到胞浆释放的影响。1m M METH处理前给予CHOP si RNA,用Western blot法检测胞浆和线粒体的细胞色素c蛋白表达的变化。结果:1 1m M METH处理b End.3细胞使ROS水平从1h开始增加,3 h达高峰,6h开始下降,至24 h时回至正常水平。2 1m M METH处理b End.3细胞导致Bcl2/Bax蛋白表达从3h开始显著下降,且呈时间依赖性。3 1m M METH处理b End.3细胞使细胞膜电位(MMP)由3h开始下降,且呈时间依赖性。4 1m M METH处理b End.3细胞24h后,细胞免疫荧光检测结果显示胞浆细胞色素c明显增加;Western blot结果示线粒体cyto c蛋白从6h开始显著下降,而胞浆细胞色素c蛋白表达显著上升,且呈时间依赖性。(20)Apocynin和NBP显著抑制了METH诱导b End.3细胞内质网应激相关蛋白GRP78/Bip、p-IRE1α、p-PERK和ATF6的表达增加。6 CHOP si RNA明显逆转了METH处理b End.3细胞引起的线粒体细胞色素c蛋白的减少和胞浆细胞色素c蛋白增加。小结:METH可诱发氧化应激与凋亡,抑制氧化应激途径可抑制内质网应激途径的激活,反过来,抑制内质网应激CHOP途径可抑制METH所触发的氧化应激,提示氧化应激与内质网应激在METH所诱导的脑微血管内皮细胞损伤中存在交互作用。结论:1 METH可导致小鼠血脑屏障通透性增加、紧密连接破坏、行为异常,内质网应激抑制剂可缓解上述作用,提示内质网应激参与了METH所诱导的血脑屏障损伤。2抑制内质网应激反应,可部分逆转METH所致脑微血管内皮细胞生存率下降、凋亡率增加、紧密连接的破坏,该作用与内质网应激分子伴侣GRP78/Bip、感受器蛋白p-PERK、p-IRE1α、ATF6以及凋亡信号CHOP和pro-caspase12有关。3氧化应激与内质网应激在METH所诱导的脑微血管内皮细胞损伤中存在交互作用。