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目的:1、临床研究:观察扶正法(益气养阴方)、祛邪法(清热解毒方)、扶正祛邪法(扶正祛邪方)对早期肺腺癌术后患者1年、2年无进展生存率及预后相关因素、肿瘤指标和免疫功能的影响,探讨扶正祛邪不同治则对早期NSCLC术后患者的临床有效性及其机制。2、实验研究:通过体内、体外实验,观察扶正祛邪不同治则对肺癌细胞增殖、肿瘤微环境中相关免疫细胞的影响,探讨扶正、祛邪最佳治则及其通过调控相关免疫细胞重塑免疫微环境以发挥抗肿瘤作用的可能分子机制。方法:1、临床研究方法:采用前瞻性随机研究方法,纳入2014年12月至2019年11月期间就诊于上海市中医医院肿瘤科早期非小细胞肺癌术后患者,应用随机数字表法分为益气养阴方组(YQYY组)、清热解毒方组(QRJD组)、扶正祛邪方组(FZQX组),并予以相应中药治疗6个月,定期随访。另纳入我院健康体检者作为健康组,比较肺癌术后患者中药治疗后与健康对照组外周血免疫细胞水平差异,同时观察中药不同治则各组治疗前后患者外周血免疫细胞、肿瘤标志物的变化、卡氏评分及对患者1年、2年无进展生存率的影响,并将早期肺腺癌术后可能的预后相关因素(性别、分组、吸烟史、饮酒史)纳入Cox多因素回归分析,筛选影响预后的关键危险因素。2、实验研究方法:首先:(1)建立Lewis肺癌皮下移植瘤小鼠模型,观察扶正、祛邪不同治则中药的抑瘤作用及对肿瘤免疫微环境中MDSCs调控。(2)建立小鼠BM-MDSCs的体外诱导模型,检测扶正、祛邪不同治则干预MDSCs表面关键免疫抑制性分子表达、细胞/趋化因子分泌、凋亡及分化情况。(3)建立MDSCs/LLC体外共培养体系,通过单克隆形成实验、伤口愈合实验、Transwell侵袭实验检测不同治则复方在共培体系下对LLC增殖、迁移及侵袭影响,筛选关键信号分子。其次,根据前期结果,我们筛选具有双重调节的功能的扶正祛邪方进行后续研究:(1)建立体内MDSCs清除肺癌移植瘤小鼠模型,观察各组抑瘤情况及脾脏免疫细胞表型。(2)采用MACS磁珠分选NK细胞,与MDSCs建立体外共培养体系,模拟体外免疫微环境,验证扶正祛邪方通过调控MDSCs功能促进NK细胞的杀伤活化受体NKG2D的表达。(3)利用关键信号因子促进剂和拮抗剂分别从正向、反向检测其参与调节的关键信号通路及肺癌增殖的相关分子,并采用信号通路阻断剂在体内验证扶正祛邪方抑制MDSCs功能阻抑肺癌细胞增殖、迁移和侵袭的分子机制。结果:1、临床研究:(1)本前瞻性随机研究,纳入早期肺腺癌术后病例257例,采用随机数字表法进行随机分组:YQYY组81例,QRJD组85例和FZQX组91例。另健康组纳入110例正常体检者。(2)无进展生存率及预后相关分析:不同治则各组比较结果,YQYY组、QRJD组和FZQX组1年无进展生存率分别为99.12%、98.12%和99.09%,组间差异无统计学意义(P>0.05)。不同治则各组2年无进展生存率分别为95.11%、93.13%、97.87%,FZQX组无进展生存率显著高于QRJD组,具有统计学差异(P<0.05);单因素分析提示有无中药干预、年龄为影响早期肺癌术后预后的独立相关因素(P<0.05)。对年龄和用药分组进行Cox多因素回归分析,FZQX组较QRJD组风险比(Hazard ratio,HR)(HR=0.31,95%CI 0.15~0.46,P=0.012)显著下降,提示扶正祛邪方干预后能显著降低早期肺癌术后患者的复发。(3)肿瘤标志物表达:(1)与治疗前相比,QRJD组治疗后能显著降低CA199[(12.32±9.96)vs(12.04±8.07)U/ml,P<0.05]、SCC[(1.03±0.58)vs(1.00±0.49)U/ml,P<0.05]水平,FZQX组治疗后能显著降低CA153[(20.86±23.74)vs(11.39±6.00)U/ml,P<0.05]水平;(2)三组治疗后组间比较,FZQX组对CA153[(11.39±6.00)vs(12.46±5.38),(11.39±6.00)vs(12.29±6.31)U/ml,P<0.05]降低作用优于YQYY组和QRJD组。(4)外周血免疫细胞水平:(1)与治疗前比较,QRJD组治疗后Treg[(1.85±1.55)vs(3.50±3.10)%,P<0.05]水平较治疗前显著降低,QRJD组和FZQX组治疗后MDSCs[(2.76±2.42)vs(5.57±3.79),(3.47±3.19)vs(5.48±3.68)%,P<0.05]水平均显著下降;FZQX组治疗后CD8+[(28.17±7.97)vs(25.23±9.53)%,P<0.05]、CD4/CD8+T细胞亚群[(2.97±5.41)vs(2.17±2.69)%,P<0.05]比例较治疗前显著升高;(2)三组治疗后组间比较,QRJD组和FZQX组治疗后对MDSCs[(2.76±2.42)vs(5.88±4.53)%,[(3.47±3.19)vs(5.88±4.53)%,P<0.05]的降低作用较YQYY组治疗后更为显著,FZQX组NK细胞[(22.44±11.70)vs(19.60±12.26)%,P<0.05]水平较QRJD组显著升高,FZQX组CD3+[(68.42±12.46)vs(66.53±10.09)%,P<0.05]、CD8+T细胞[(28.17±7.97)vs(23.48±8.64)%,P<0.05]表达水平显著高于QRJD组。(5)肿瘤相关炎性因子水平:(1)不同治则治疗前后比较,FZQX组治疗后较治疗前IL-1β[(0.21±0.01)vs(3.47±3.89)pg/ml,P<0.05]、IL-10[(8.75±3.67)vs(15.02±6.89)pg/ml,P<0.05]水平显著降低。(2)不同治则各组治疗后组间比较,QRJD组和FZQX组中IL-1β[(0.98±2.96)vs(1.9±3.21),(0.21±0.01)vs(1.9±3.21)%,P<0.05]、IL-10[(6.85±1.26)vs(15.12±19.02),(8.75±3.67)vs(15.12±19.02)%,P<0.05]表达水平显著低于YQYY组,其中,FZQX组对IL-1β降低作用优于QRJD组,差异有统计学意义(P<0.05)。(6)KPS评分:(1)各组经治前后比较,FZQX组治疗后较治疗前KPS评分[(85.82±6.20)vs(80.88±6.68),P<0.05]升高;(2)治疗后组间比较,YQYY组和FZQX组KPS评分较QRJD组有升高趋势,但无统计学差异(P>0.05)。2、实验研究:(1)NS组、YQYY组、QRJD组和FZQX组荷瘤小鼠的中位生存期分别为44d、55.5d、40d、66.5d;YQYY组、QRJD组、FZQX组抑瘤率分别为30.01%、49.65%、50.55%(P<0.05)。QRJD组和FZQX组较YQYY组能显著降低荷瘤小鼠瘤体MDSCs[(6.52±1.47)vs(17.59±6.89),(10.23±4.98)vs(17.59±6.89)%,P<0.05]比例,关键免疫抑制分子Arg1[(0.34±0.17)vs(0.85±0.69),(0.51±0.49)vs(0.85±0.69),P<0.05]、i NOS[(0.40±0.47)vs(0.67±0.84),(0.31±0.75)vs(0.67±0.84),P<0.05]、NO[(0.68±0.08)vs(0.88±0.41),(0.75±0.29)vs(0.88±0.41),P<0.05]表达及增殖和活化相关因子PGE2[(0.13±0.11)vs(0.48±0.04),(0.48±0.21)vs(0.48±0.04),P<0.05]、MMP9[(0.20±0.17)vs(0.88±0.11),(0.32±0.05)vs(0.88±0.11),P<0.05]表达;YQYY组和FZQX组较QRJD组能够显著促进荷瘤小鼠脾脏NK细胞的杀伤活性[(3.56±0.34)vs(2.31±0.56),(4.69±0.7)vs(2.31±0.56),P<0.05];蛋白层面验证显示,三组均能抑制瘤体中肿瘤增殖相关蛋白(MMP9、PTGER2、PCNA)、肿瘤相关炎性因子(IL-1β、IL-10)表达及NF-κB通路活性,QRJD组和FZQX组抑制作用更显著。(2)建立BM-MDSCs体外诱导模型并鉴定,CD11b+Gr-1+细胞比例>80%;CCK8筛选三组中药干预MDSCs的有效作用浓度分别为60mg/ml、20mgml、60mg/ml;蛋白水平检测QRJD组和FZQX组能够抑制MDSCs COX2、PD-L1、IL-1R2、PTGER2蛋白表达,抑制NF-κB通路活性。QRJD组和FZQX组较YQYY组可促进MDSCs细胞早期凋亡[(32.85±4.59)vs(15.24±2.39),(36.48±6.21)vs(15.24±2.39),P<0.05],抑制其ROS释放[(36.43±8.73)vs(76.22±6.89),(42.09±10.39)vs(76.22±6.89),P<0.01],同时,FZQX组较NS组能促进MDSCs向DC细胞[(32.19±8.27)vs(17.23±4.58),P<0.01]分化。在中药组干预后的共培养体系中,QRJD组和FZQX组能显著抑制LLC细胞的增殖、迁移和增殖。建立MDSCs清除的荷瘤小鼠模型验证了MDSCs是肿瘤生长关键环节,NS组、FZQX组、GEM组和GEM+F组小鼠体重分别为25.14±0.75g、25.9±1.4g、21.89±1.92g、25.65±1.03g,瘤体体积1300.37±354.48mm~3、706.69±134.35 mm~3、378.3±93.61 mm~3、290.93±103.43mm~3,瘤体MDSCs细胞浸润17.25±5.69%、5.13±2.13%、2.03±0.98%、3.14±0.78%,根据以上数据显示,FZQX组与GEM组比较无显著差异(P>0.05),蛋白层面检测,FZQX能够抑制共培养条件下IL-1β和NF-κB的表达(P<0.05)。(3)模拟体外微环境细胞相互作用,建立扶正祛邪方干预后的MDSCs/NK细胞共培体系,较Ctrl组相比,NK细胞表面受体NKG2D[(59.13±7.89)vs(25.89±6.39)%,P<0.05]表达升高;体外正向、反向验证扶正祛邪方能够通过调控MDSCs细胞IL-1β表达抑制NF-κB通路活化,并抑制PCNA、Bcl2、MMP9、VEGFR、IL-β表达(P<0.05)。建立NF-κB通路抑制的荷瘤小鼠模型显示,扶正祛邪组能抑制肿瘤增殖蛋白及因子(MMP9、PCNA、IL-1β)表达(P<0.05)和MDSCs增殖活化相关蛋白(COX2、PDL1)蛋白表达(P<0.05),与单纯NF-κB抑制剂组作用相当。结论:1、临床研究:(1)扶正祛邪方干预能提高早期肺腺癌术后患者的2年无进展生存率,延缓肿瘤复发,并且有无扶正祛邪方干预显著降低肺癌术后患者复发风险,并是早期肺癌术后患者预后的独立影响因子。(2)中药组中扶正法(益气养阴方)、祛邪法(清热解毒方)、扶正祛邪法(扶正祛邪方)各组均能改善早期NSCLC术后患者KPS评分,改善生活质量。此外,扶正祛邪方既能够发挥“扶正”作用促进正向免疫调节细胞(CD8+T细胞、NK细胞)表达,又能发挥“祛邪”作用抑制免疫环境中负向免疫调节细胞(MDSCs、Treg)表型,降低肿瘤标志物及炎性因子水平,从而改善患者预后。2、实验研究:(1)扶正祛邪不同治则均能抑制肺癌小鼠皮下移植瘤的生长,参与调控MDSCs细胞的增殖及活化;(2)扶正祛邪方通过调控MDSCs功能抑制肺癌细胞的增殖、迁移及侵袭;(3)扶正祛邪方通过IL-1β/NF-κB信号通路抑制MDSCs增殖和活化而重塑肺癌免疫微环境。