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背景急性呼吸窘迫综合征（Acute respiratory distress syndrome,ARDS）是由多种诱因导致的急性缺氧性呼吸衰竭,为临床上常见危重症。肺微血管内皮细胞（pulmonary microvascular endothelial cells,PMVECs）通透性增加所致的非心源性肺水肿是ARDS发病的关键环节。在恶性因素刺激时,PMVECs是肺中最主要的靶细胞,其结构和功能的完整性对于肺正常生理功能的维持至关重要。因此,探讨PMVECs损伤及单层通透性增加的发生机制是研究ARDS发生发展的重要方向。据报道,神经酰胺可在内皮细胞中高水平产出,并且与血管内皮屏障的破坏以及高通透性相关。然而,神经酰胺触发反应的特异性取决于神经酰胺的种类,负责其上调的酶促途径以及发生反应的细胞类型。在细菌脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）诱导的PMVECs高通透性过程中,PMVECs中神经酰胺合成的酶促途径以及下游的信号转导途径均未见报道。因此,本课题以LPS诱导大鼠PMVECs损伤为模型,探讨神经酰胺的生成在LPS诱导的PMVECs高通透性中的作用。第一部分抑制神经酰胺的生成对脂多糖诱导的肺微血管内皮细胞凋亡以及高通透性的影响目的研究神经酰胺的生成在LPS诱导的PMVECs凋亡损伤以及高通透性中作用。方法1.细胞实验:体外培养大鼠PMVECs,通过对跨内皮电阻（transendothelial electrical resistance,TER）、异硫氰酸荧光素标记的白蛋白（fluorescein isothiocyanate-bovine serum albumin,FITC-BSA）和FITC-dextran的检测评估PMVECs通透性;Annexin V-FITC/PI双染法检测PMVECs凋亡;酸性鞘磷脂酶（acid sphingomyelinase,ASMase）试剂盒检测酸性鞘磷脂酶活性;酶联免疫吸附测定法（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测神经酰胺含量;Western blot检测丝氨酸棕榈酰转移酶（Serine palmitoyl transferase,SPT）、Bax和Bcl-2的蛋白表达;RT-PCR检测SPT m RNA表达。2.动物实验:HE染色和病理评分观察肺组织病理变化;肺组织湿/干比（W/D）和肺通透性指数（Lung permeability index,LPI）评价肺水肿和肺血管通透性;Western blot检测凋亡相关蛋白表达和分光光度法检测Caspase3活性来评价肺组织细胞凋亡损伤。结果1.倒置显微镜下观察PMVECs形态呈铺路石样,FITC-BSI结合实验后荧光显微镜观察为日晕般绿色荧光。2.LPS作用浓度为10μg/m L时,PMVECs的TER值最小以及对FITC-BSA通透性最大;10μg/m L LPS作用于PMVECs不同时间时,在第16 h时TER值最小,而对FITC-BSA的通透性呈时间依赖性增加。3.10μg/m L LPS作用于PMVECs 8 h内无凋亡损伤,在12 h后PMVECs的凋亡显著增加,并持续24 h。Q-VD-OPH（Q-VD,50μmol/L）和Z-VAD-FMK（Z-VAD,100μmol/L）显著抑制LPS诱导的PMVECs凋亡。Q-VD和Z-VAD对LPS诱导PMVECs的TER值的变化没有影响,而Q-VD显著降低LPS诱导PMVECs在12 h后对FITC-BSA和FITC-dextran的通透性,Z-VAD显著降低LPS诱导PMVECs在12 h后对FITC-BSA和在16 h后对FITC-dextran的通透性。4.10μg/m L LPS可在4 h内导致PMVECs中神经酰胺含量急剧增加,并在16 h达到峰值;与此相一致的,ASMase活性在4 h内显著升高,而ASMase抑制剂丙咪嗪（50μmol/L）,则显著抑制LPS激活的ASMase活性和神经酰胺的生成;中性鞘磷脂酶（neutral sphingomyelinase,NSMase）抑制剂GW4869（20μmol/L）则不抑制神经酰胺生成的增加。SPT的抑制剂多球壳菌素（Myriocin,50 nmol/L）和SPTLC1si RNA对LPS诱导的PMVECs中早期神经酰胺的上调（8 h内）没有影响,但可明显抑制中晚期（12 h后）神经酰胺的生成。5.丙咪嗪（50μmol/L）可显著改善LPS（10μg/m L）诱导的PMVECs TER值降低以及对FITC-BSA通透性的增加;而myriocin（50 nmol/L）和SPTLC1 si RNA对LPS诱导的PMVECs TER值没有任何影响,但可显著改善LPS诱导PMVECs中晚期（12 h后）对FITC-BSA的通透性。此外,进一步的研究显示,myriocin和SPTLC1 si RNA可明显抑制LPS诱导的PMVECs在24 h内的凋亡。6.Myriocin可显著改善LPS诱导的大鼠肺组织病理变化、肺水肿和肺血管通透性。同时,myriocin可显著抑制LPS诱导的大鼠肺组织凋亡相关蛋白表达以及Caspase3活性。结论LPS通过ASMase的激活迅速上调神经酰胺导致早期（8 h内）PMVECs高通透性,以及随后通过从头合成途径合成的神经酰胺导致依赖凋亡的中晚期（12 h后）PMVECs高通透性。第二部分脂多糖通过ASMase/Ceramide通路诱导早期肺微血管内皮细胞高通透性的机制研究目的阐明在LPS诱导的早期PMVECs高通透性过程中,ASMase的激活和随后产生的神经酰胺参与的具体信号通路。方法瞬时受体电位阳离子通道6（Transient receptor potential cation channel 6,TRPC6）、闭锁小带蛋白1（Zonula Occludens 1,ZO-1）、血管内皮钙粘蛋白（Vascular endothelial-cadherin,VE-cadherin）的蛋白表达经Western blot检测;RT-PCR检测TRPC6 m RNA的表达;TER和FITC-BSA法检测PMVECs通透性;Rho A活化经Rho A活性检测试剂盒检测;流式细胞术检测细胞内钙离子含量;细胞免疫荧光方法检测F-actin细胞骨架和细胞间连接蛋白结构变化。结果1.丙咪嗪（50μmol/L）和TRPC6 si RNA均显著抑制由LPS（10μg/m L）诱导的PMVECs中TRPC6和细胞间连接蛋白的表达。2.丙咪嗪和TRPC6 si RNA均显著抑制LPS诱导的Ca2+内流和Rho A的激活。3.丙咪嗪和TRPC6 si RNA均显著抑制LPS诱导的PMVECs中骨架重排、细胞间连接的破坏和高通透性。4.丙咪嗪可显著抑制LPS诱导的PMVECs中神经酰胺的生成,而TRPC6 si RNA对PMVECs中神经酰胺的生成没有影响。结论在LPS诱导的早期PMVECs高通透性阶段,由ASMase激活产生的神经酰胺通过诱导TRPC6表达上调和钙离子内流进一步激活Rho A途径,Rho A的激活进一步诱导PMVECs骨架重排和细胞间连接的破坏,最终导致PMVECs通透性的增加。第三部分神经酰胺调控Txnip表达在脂多糖致肺微血管内皮细胞凋亡中的机制研究目的探讨在LPS诱导的PMVECs凋亡中由神经酰胺介导的相关分子机制。方法1.细胞实验:Annexin V-FITC/PI双染法检测PMVECs凋亡;酶联免疫吸附测定法（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测神经酰胺含量;Western blot检测硫氧还蛋白互作蛋白（Thioredoxin interacting protein,Txnip）、硫氧还蛋白（Thioredoxin,Trx）、Bax、Bcl-2、JNK、P-JNK、P38、P-P38、凋亡信号调节激酶1（Apoptosis signal-regulating kinase 1,ASK1）和P-ASK1的蛋白表达。胰岛素二硫键还原法检测Trx活性;免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）检测Trx-Txnip和Trx-ASK1之间相互作用的变化。RT-PCR检测Txnip m RNA表达。2.动物实验:HE染色和病理评分观察肺组织病理变化;肺组织湿/干比（W/D）和肺通透性指数（Lung permeability index,LPI）评价肺水肿和肺血管通透性;分光光度法检测检测Caspase3活性;Western blot检测Txnip、Trx、Bax、Bcl-2、JNK、P-JNK、P38、P-P38、ASK1和P-ASK1的蛋白表达。结果1.Myriocin（50 nmol/L）和SPT si RNA显著抑制LPS（10μg/m L）诱导的PMVECs中JNK和P38的激活以及凋亡相关蛋白的表达;LPS上调Txnip的表达,促进了Txnip与Trx的相互结合,下调Trx活性,激活ASK1;然而,myriocin和SPT si RNA可抑制上述反应。2.SB203580（P38抑制剂,10μmol/L）与SP600125（JNK抑制剂,20μmol/L）显著抑制LPS诱导的PMVECs中P38和JNK的活化、细胞凋亡以及凋亡相关蛋白的表达,但无法抑制神经酰胺含量的上调。3.Txnip抑制剂维拉帕米（Verapamil,50μmol/L）和Txnip si RNA显著抑制了C8-Ceramide（10μmol/L）诱导的PMVECs中P38和JNK的活化、细胞凋亡以及凋亡相关蛋白的表达;同时,C8-Ceramide上调PMVECs中Txnip的表达,促进了Txnip与Trx的相互结合,下调Trx活性,激活ASK1;然而,应用Verapamil和Txnip si RNA抑制Txnip的表达可抑制上述反应。4.气管内滴注C8-Ceramide诱导大鼠肺损伤,肺组织病理改变符合肺损伤病理变化。Verapamil可显著改善C8-Ceramide诱导的大鼠肺组织病理变化、肺水肿和肺血管通透性。同时,Verapamil可显著抑制由C8-Ceramide诱导的大鼠肺组织中凋亡相关蛋白和Txnip蛋白的表达以及ASK1和Caspase3的活化。结论在LPS诱导的依赖凋亡的中晚期PMVECs高通透性阶段,通过从头合成途径合成的神经酰胺诱导PMVECs的凋亡损伤,其中Txnip的表达上调抑制Trx活性并随后激活ASK1,作用于神经酰胺诱导的P38 MAPK、JNK的活化和细胞凋亡的上游。