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目的1.观察不同病程PD大鼠DAT动态变化,并探讨该变化与TH之间的关系。2.探讨中脑多巴胺神经元不同毁损大鼠纹状体中DAT的密度及功能变化。3.探讨中脑多巴胺神经元不同毁损大鼠血清MLT的变化。4.研究中脑多巴胺神经元不同毁损大鼠黑质TH阳性细胞数与DAT相关性。5.研究中脑多巴胺神经元不同毁损大鼠黑质TH阳性细胞数与MLT相关性。6.探讨中脑多巴胺神经元不同毁损大鼠DAT与MLT的相关性。方法:1.采用双点注射6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)至大鼠右侧黑质致密部(Substantia nigra pars compacta,SNc)和前脑内侧束(Medial forebrain bundle,MFB)建立偏侧PD模型,或单点注射6-OHDA至右侧MFB,通过控制不同的给药剂量建立偏侧不同毁损程度的中脑多巴胺神经元大鼠模型。2.中脑多巴胺神经元不同毁损大鼠的鉴定:阿扑吗啡(Apomorphine,APO)诱导的旋转行为的检测,观察不同6-OHDA剂量组大鼠的旋转情况。通常将旋转圈数>210r/30min,视为成功的帕金森疾病(Parkinson’s disease,PD)模型。3.大鼠心脏活体采血:大鼠腹腔注射过量10%水合氯醛,深度麻醉后将其四肢固定,迅速打开胸腔,剥离心脏周围结缔组织,充分暴露心脏,剪开右心耳,迅速取血约4.5ml。室温静置30min,离心取血清,-20°C保存,同一批次测定MLT。4.建模后2W、4W、6W PD大鼠分别尾静脉注射99m Tc-TRODAT-1,1h后取左右纹状体,以γ计数仪测定放射性计数,并计算单位质量的左、右放射性计数率以及左、右纹状体单位质量的放射性计数比值。5.经异氟烷气体麻醉后的大鼠,尾静脉注射99m Tc-TRODAT-1标记多巴胺转运蛋白(Dopamine transporter,DAT),运用小动物活体成像系统检测纹状体区域DAT的密度及功能变化。6.ELISA检测血清褪黑素(Melatonin,MLT):采用ELISA检测大鼠血清MLT水平,了解MLT与中脑多巴胺神经元不同毁损大鼠旋转圈数及DAT的关系。7.免疫组织化学检测:取中脑黑质制成石蜡块,4mm连续切片,小鼠抗大鼠TH抗体,免疫组化染色,了解中脑黑质DA能神经元的变化及与DAT、MLT水平的关系。结果:1.不同病程PD大鼠毁损侧纹状体放射计数明显低于健侧,建模后2W、4W、6W PD大鼠DAT相对放射计数较健侧分别降低了16.8%、35.9%和50.1%(p<0.05~0.001);不同病程PD大鼠毁损侧纹状体DAT的相对放射计数与TH阳性细胞数呈高度的正相关(p<0.01,r=0.9,n=15)。2.6-OHDA注射2mg剂量组大鼠不旋转,仅出现行动迟缓、少动、竖毛、尾僵直等异常行为表现;4mg剂量组大鼠2W、4W、6W、8W APO诱导的旋转圈数均<210r/30min;8mg剂量组大鼠2W、4W、6W、8W APO诱导的旋转圈均>210r/30min。4mg和8mg剂量组大鼠诱导的旋转圈数均明显高于正常对照组及假手术组,统计学上有显著性差异(p<0.001)。3.术后8W血清MLT水平:正常对照组的血清MLT水平为(44.67±1.10)pg/ml,假手术组(45.21±1.19)pg/ml,2mg剂量组(49.44±1.54)pg/ml,4mg剂量组(58.35±1.73)pg/ml,8mg剂量组(66.27±1.94)pg/ml。中脑多巴胺神经元不同毁损大鼠血清MLT浓度分别与正常对照组及假手术组比较,统计学上均有显著性差异(p<0.001)。4.6-OHDA注射2mg剂量组毁损(右)侧中脑黑质TH阳性神经元为(66.25±13.68)较健(左)侧(121.94±10.87)减少43.62%±15.6%;4mg剂量组毁损侧为(26.38±3.08)较健侧(116.19±17.11)减少59.9%±8.74%;8mg剂量组毁损侧为(4.13±4.09)较健侧(98.88±14.09)减少95.17%±4.64%。2mg、4mg和8mg剂量组毁损侧与正常对照组及假手术组比较,差异均有显著性意义(p<0.001);8mg剂量组健侧与正常对照组及假手术组比较,差异也有显著性意义(p<0.05);而假手术组毁损侧和健侧中脑黑质TH免疫反应阳性神经元与正常对照组左右两侧相比差异均无统计学意义(p>0.05)。5.建模后8W纹状体DAT放射性计数为:正常对照组左侧纹状体DAT放射性计数为(1569.23±295.38)bq/mm3、右侧为(1498.57±275.73)bq/mm3;2mg剂量组健(左)侧(1258.97±181.96)bq/mm3、毁损(右)侧(1174.73±65.94)bq/mm3;4mg剂量组健侧(1033.45±116.66)bq/mm3、毁损侧(943.32±47.63)bq/mm3;8mg剂量组健侧(994.15±248.86)bq/mm3、毁损侧(679.84±131.79)bq/mm3。2mg、4mg和8mg剂量组毁损侧与正常对照组同侧比较,差异均有显著性意义(p<0.05)。2mg、4mg和8mg剂量组健侧与正常对照组同侧比较,差异也均有显著性意义(p<0.05)。6.建模后8W中脑多巴胺神经元不同毁损大鼠血清MLT浓度与毁损侧纹状体DAT平均放射性计数呈显著的负相关性,|r|=0.873,(p<0.01,n=16);MLT浓度与毁损侧黑质TH免疫阳性细胞数呈显著的负相关性,|r|=0.94(p<0.01,n=16);DAT与TH呈显著的正相关性,|r|=0.863(p<0.01,n=16)。结论:1.PD大鼠纹状体DAT含量随着病程的增加逐渐减少,99mTc-PRODAT-1的放射性分布能够较准确的反映突触前DA能神经元的变化。2.中脑多巴胺神经元不同毁损大鼠DAT水平与毁损程度呈反比,可能与PD的进展有关。3.中脑多巴胺神经元不同毁损大鼠血清MLT水平随毁损程度增加逐渐增高,可能与PD的进展有关。4.血清MLT水平与纹状体DAT水平可能是临床判断PD病严重程度的一个潜在指标。