目的：STAT3(signal transducer and activator of transcription3)是一种双功能蛋白，存在于细胞质中，并与酪氨酸磷酸化的信号通路相偶联，是JAK-STAT途径中一种重要的底物，在信号转导和转录过程中具有关键性作用；在许多体内外实验中发现，STAT3可以调控许多种致瘤的信号通路。STAT3还可以通过EGFR，Src，IL-6等生长因子、细胞因子的激活，使其DNA的结合活性上调，调控相应靶基因的转录。并且不断将生存信号向肿瘤细胞转导，发挥促进肿瘤细胞生存、抑制细胞凋亡的作用。EGFR,Src等受体和非受体酪氨酸激酶是VEGF的主要诱导因素，而这些酪氨酸激酶信号是通过多种途径传递的，STAT3则是这些路径的一个交汇点，可以直接参与调节VEGF的表达，调控血管的生成。STAT3信号通路与细胞的分化、增殖、血管生成、凋亡、免疫逃逸和侵袭转移密切相关。STAT3通路持续的激活可引起细胞异常增殖及恶性转化。　　 在我国，乳腺癌呈逐年上升趋势，在部分大城市占女性恶性肿瘤之首，外科治疗历史悠久，但治疗效果并无突破性改善，生物治疗被誉为乳腺癌治疗的曙光。乳腺癌是一个多突变、多因素积累的过程，乳腺癌的病因及发病机理目前尚不十分清楚，随着近年来分子生物学领域的迅猛发展，在分子水平上，人们对乳腺癌的发病机制及治疗的探讨也更加广泛，而且也取得了一定成果。目前，与乳腺癌的发生、发展及转移过程有关蛋白的异常激活或过度表达的研究更加受到人们关注。研究发现在多种人类恶性肿瘤中都有Stat3的过度激活，沉默Stat3的表达能够有效抑制肿瘤的增殖和生长。　　 RNAi技术是指在生物体内经由双链RNA介导其同源序列mRNA发生的特异性降解，进而引起基因沉默。可以针对信号通路中的多个基因或基因簇所共同具有的序列，使多个基因的表达同时被抑制，从而更有效地发挥抑制肿瘤生长的作用。RNAi是一种快捷，高效的技术手段，可特异性地抑制基因的表达，为肿瘤的基因治疗研究提供了有力的方法。目前在分子生物学研究中RNAi是最为活跃的热点之一。　　 在本研究中，在用免疫组化法检测STAT3及pSTAT3在乳腺癌中的表达情况后，我们利用RNA干扰技术，以STAT3siRNA转染人乳腺癌MCF7细胞，用Western blot及RT-PCR检测STAT3siRNA对STAT3mRNA和蛋白表达的抑制，并观察STAT3siRNA对MCF7细胞增殖和凋亡的作用。进一步进行裸鼠移植瘤动物实验，并检测移植瘤中STAT3mRNA和蛋白表达受抑制的情况，来进一步验证体外实验中的发现，为乳腺癌的基因治疗提供理论基础。　　 方法：本课题主要研究乳腺癌中STAT3的异常表达，并应用RNA干扰技术沉默STAT3在乳腺癌细胞的表达，观察其对乳腺癌恶性表型的影响。实验主要分三部分：　　 第一部分中采用免疫组织化学方法，对36例乳腺癌临床标本和10例正常乳腺组织标本进行检测，初步筛选和验证STAT3蛋白的异常表达情况，观察STAT3蛋白在乳腺癌组织及正常乳腺组织中的表达情况，探讨STAT3异常表达与乳腺癌患者临床及病理特征之间的关系，研究STAT3表达对乳腺癌患者临床诊断及预后的意义。　　 第二部分主要是STAT3siRNA转染乳腺癌MCF7细胞的体外实验。应用RNA干涉技术以脂质体转染试剂介导STAT3siRNA靶向转染人乳腺癌MCF7细胞系后，采用TR-PCR检测STAT3基因的沉默情况，进一步用Western blot技术检测了RNAi沉默STAT3基因表达后，STAT3蛋白表达的变化。再用MTT方法检测STAT3siRNA转染前后细胞增殖能力的变化，用流式细胞检测技术分析了转染前后细胞凋亡情况的改变。　　 第三部分中，首先将STAT3siRNA体外转染乳腺癌MCF7细胞系，于裸鼠皮下注射转染后的细胞，建立裸鼠乳腺癌皮下移植瘤动物模型，动态观察荷瘤鼠体内肿瘤生长情况，接种瘤细胞后第4天，各组均出现肉眼可见瘤体，开始测量荷瘤鼠肿瘤大小，每3天1次测量并记录肿瘤的长径(L)和短径(w)，共测7次，计算肿瘤体积。依据记录数据绘制裸鼠的肿瘤生长曲线。接种第7天，每组各取3只荷瘤鼠颈椎脱臼处死，完整剥离肿块，分别用RT-PCR.及Westem blot检测肿块中STAT3 mRNA及STAT3蛋白的变化，对体外实验的结果进一步验证。其余每组5只继续观察。接种22天后，颈椎脱臼处死全部裸鼠，迅速剪开皮肤，完整剥离肿块并称重。并对处死的荷瘤鼠及剥离的肿块进行拍照。　　 结果：　　 1 STAT3与pSTAT3在乳腺癌中的表达检测结果显示：　　 STAT3阳性表达部位主要位于胞浆，呈棕黄染色。pSTAT3阳性表达部位主要位于细胞核，呈棕黄色。乳腺癌组织中STAT3、pSTAT3蛋白的高表达率分别为58.30％、55.56％。正常乳腺组织中分别为10％、0％。乳腺癌组阳性率显著高于正常乳腺组(P＜0.05)，差异有统计学意义。在乳腺癌中STAT3、pSTAT3阳性细胞率与乳腺癌的临床分期及淋巴结转移之间有相关性，在临床分期高及有淋巴结转移的病例中，STAT3、pSTAT3蛋白表达阳性率高(P＜0.05);STAT3蛋白在癌组织中的表达与年龄和肿瘤大小、病理类型均无明显关系(P＞0.05)。　　 2 Stat3iRNA对乳腺癌MCF7细胞生长抑制的体外实验结果显示：STAT3 mRNA检测结果：从条带显示上看，STAT3siRNA转染组STAT3mRNA的表达量较空白对照组及非特异siRNA转染组在48h时明显减少，非特异siRNA转染组的表达量与空白对照组无明显差异。定量分析结果( STAT3/β-actin)显示： STAT3siRNA转染组（24h0.664±0.007，48h0.327±0.020）较空白对照组（1.093±0.018）及非特异siRNA转染组(24h1.026±0.04848h1.035±0.050)明显减少，48h值最低(P＜0.05)。非特异siRNA转染组与空白对照组没有明显差别(P＞0.05)。各组细胞经Western blot检测分析显示，内参照actin为均一显影的条带，而STAT3显影条带密度不同．其中，非特异siRNA转染组与空白对照组细胞STAT3表达量较高，而STAT3siRNA转染组细胞STAT3表达量显著下降，在72h时最明显。吸光度值分析(STAT3/β-actin)结果显示：STAT3siRNA转染组（48h1.258±0.017，72h0.153±0.006）较空白对照组（1.374±0.022）及非特异siRNA转染组(48h1.391±0.051，72h1.320±0.033)明显减少，72h值最低(P＜0.05)。而非特异siRNA转染组与空白对照组没有明显差别(P＞0.05)；从MTT检测结果表明，STAT3siRNA转染组肿瘤细胞A490nm的吸光值明显减少，增殖能力于48h及72h后明显下降，与空白对照组及非特异siRNA转染组相比较，细胞生长受到明显抑制(P＜0.05)。其生长抑制率，STAT3siRNA转染组较空白对照组及非特异siRNA转染组明显增高(P＜0.05)。表明Stat3 siRNA具有抑制乳腺癌细胞增殖的能力．流式细胞仪分析显示，STAT3siRNA转染组细胞凋亡率为14.79±0.22，明显高于空白对照组及非特异siRNA转染组(P＜0.01)；而空白对照组及非特异siRNA转染组间凋亡率无显著性差异(P＞0.05)。STAT3siRNA转染组出现明显的凋亡峰AH，而空白对照组及非特异siRNA转染组均未见明显凋亡峰。　　 3 STAT3siRNA对MCF7细胞裸鼠皮下移植瘤的抑制作用实验结果显示：　　 成瘤情况：非特异siRNA-MCF7和STAT3siRNA-MCF7细胞分别接种于裸鼠背部皮下，经过4d后在其接种部位形成肉眼可见的肿瘤结节，至第22天观察结束时，空白对照组、非特异siRNA转染组的体积及瘤重明显大于STAT3siRNA转染组(P＜0.05)．而空白对照组、非特异siRNA转染组的体积及瘤重无明显差异(P＞0.05)。空白对照组、非特异siRNA-MCF7转染组裸鼠的营养状况明显差于STAT3 siRNA转染组。连续观察裸鼠背部移植瘤的生长情况，从第四天开始，每3天测量一次每只裸鼠肿瘤的长径及短径，共测七次，绘制各组裸鼠肿瘤的生长曲线图。结果显示，随着时间的推移，3组肿瘤的生长速度明显不同，空白对照组、非特异siRNA转染组的生长速度明显快于STAT3 siRNA转染组．空白对照组、非特异siRNA转染组的生长速度较接近。瘤细胞STAT3 mRNA检测结果：STAT3siRNA转染组STAT3 mRNA的表达水平（条带窄小，密度低）较空白对照组及非特异siRNA转染组明显减低，非特异siRNA转染组的STAT3 mRNA表达水平与空白对照组近似。定量分析(STAT3/actin)结果显示，STAT3siRNA转染组（0.743±0.093）较空白对照组（1.106±0.039）及非特异siRNA转染组（1.016±0.111）明显减低(P＜0.05)。而非特异siRNA转染组与空白对照组没有明显差别(P＞0.05)。各组移植瘤经Western blot检测分析显示，内参照actin为均一显影的条带，而STAT3显影条带密度不同．其中，非特异siRNA转染组与空白对照组STAT3表达量较高，而STAT3siRNA转染组细胞STAT3表达量显著下降（条带密度明显降低）．定量分析(STAT3/actin)结果显示，STAT3siRNA转染组（0.839±0.274）较空白对照组（1.034±0.101）及非特异siRNA转染组（0.963±0.075）明显减低(P＜0.05)。而非特异siRNA转染组与空白对照组没有明显差别(P＞0.05)。　　 结论：　　 1 STAT3、pSTAT3蛋白在乳腺癌组织中呈高表达，且与肿瘤TNM分期和淋巴结转移情况有关，TNM分期较晚的和有淋巴结转移的呈显著高表达。STAT3检测可作为乳腺癌的辅助诊断的一个指标。　　 2 STAT3siRNA能够有效沉默STAT3基因，下调MCF7细胞系中STAT3mRNA及蛋白的表达，使细胞凋亡增加，细胞增殖能力明显下降。明显抑制乳腺癌MCF7细胞的体外生长。　　 3 STAT3siRNA在体内环境下仍然能够沉默STAT3基因，能够明显下调裸鼠移植瘤中STAT3mRNA及蛋白的表达。并使活体肿瘤的生长受到显著抑制。与体外试验结果一致。　　 4 STAT3可以作为抗肿瘤治疗的新靶标，RNA干扰技术能够对基因进行有效沉默，有潜在的临床应用前景。