为了研究转录因子GATA4在神经嵴及其衍生组织发育过程中的具体作用机制,本课题使用了条件性敲基因小鼠Wnt1-Cre;Gata4fl/fl,以达到在神经嵴细胞中特异性敲除GATA4的目的。利用免疫组织化学染色的方法,观察GATA4在小鼠颅颌面组织时空表达情况:在胚胎14.5天（embryonic day 14.5,E14.5）、出生后1天（postnatal day 1,P1）、出生后14天（postnatal day 14,P14）,GATA4在小鼠下颌骨、腭部、牙齿的各个发育阶段都有高表达。表型分析发现,Wnt1-Cre;Gata4fl/fl小鼠体型明显减小。骨架染色结果显示,Wnt1-Cre;Gata4fl/fl小鼠颅缝闭合不全、下颌骨发育不足后缩畸形。影像学（micro-CT）、免疫荧光染色、组织化学染色结果表明:Wnt1-Cre;Gata4fl/fl的小鼠下颌骨、腭骨、额骨呈现出显著的骨矿化程度降低;牙根发育异常,短根畸形;冯库萨（Von kossa）、总胶原（total collagen）染色,collagenⅠ免疫荧光染色结果提示,敲基因鼠的骨量显著降低;H&E染色结果显示,神经嵴细胞特异性敲除GATA4后,小鼠表现出室间隔缺损（ventricular septal defect,VSD）、心脏代偿性肥大的表型。本课题进一步研究神经嵴细胞特异性敲除GATA4后所影响的神经嵴发育具体时期。结果如下:在迁徙期时,对E9.5天WT及Wnt1-Cre;Gata4fl/fl的小鼠进行SOX9的整胚免疫荧光染色,标记神经嵴细胞及第一咽弓（pharyngeal arch 1,pa1）,两组小鼠第一咽弓在大小和形态上没有显著性差异;选取E10.5天的胎鼠进行PHH3（phosphohistone H3,PHH3）,TUNEL（terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling,TUNEL）的免疫荧光染色,对细胞的增殖、凋亡进行统计分析,结果无显著性差异,提示GATA4特异性敲除后没有影响神经嵴的迁徙期。对于神经嵴发育的分化时期,选择E14.5天的小鼠对其下颌组织进行增殖、凋亡的分析,发现敲基因组小鼠增殖的细胞数目显著降低,而细胞凋亡没有受到影响。综上所述,GATA4对小鼠神经嵴分化时期的细胞增殖起到促进的作用,同时也参与了颅颌面部相关衍生物发育过程的调控。体外实验部分,通过培养小鼠神经嵴细胞,转染小发卡RNA（small hairpin RNA,shRNA）敲低GATA4的表达,进行细胞学的研究。细胞增殖（cell counting kit-8,CCK-8）及流式凋亡实验表明,敲低GATA4后影响了神经嵴细胞的增殖,但细胞凋亡没有受到影响。划痕实验中,敲低组细胞迁徙能力明显降低。对神经嵴细胞进行成骨方向的矿化诱导,在矿化14天之后发现,GATA4敲低组钙结节生成数目显著降低,提示成骨矿化能力受到影响。提取E10.5天小鼠第一咽弓组织mRNA进行qRT-PCR检测,本研究选择了9个与神经嵴发育相关的基因发现:Wnt1-Cre;Gata4fl/fl组中,Sox9、Snail2、Ets1、Msx1、AP-2、Twist的表达显著降低,而Nestin、Pax3、HNK-1的表达没有改变。上述结果提示GATA4对神经嵴发育过程中的相关功能具有重要的调控作用。机制探究部分,本实验通过同位素标记相对和绝对定量技术（isobaric tags for relative and absolute quantification,iTRAQ）筛选GATA4在神经嵴细胞中潜在的下游靶基因。在所检测的1888个蛋白中,在GATA4敲低后有43个蛋白表达上调,19个蛋白表达显著下调,BARX1是其中下调的蛋白之一。鉴于BARX1在咽弓中高表达,且对磨牙、软骨、下颌骨发育均有重要调控作用,因此本实验选择BARX1继续研究。为了验证iTRAQ的结果,实验通过qRT-PCR、蛋白质印迹法（Western blot）实验证实,神经嵴细胞敲低GATA4后,Barx1表达随之下调。实验预测了转录因子GATA4与Barx1的启动子区域可能存在的两个结合位点。通过双荧光素酶报告基因实验、凝胶迁移率实验（electrophoretic mobility shift assay,EMSA）及染色质免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation assay,ChIP）实验进行结合位点的验证。结果表明:在双荧光素酶报告基因实验中,过表达GATA4之后,两个结合位点的荧光活性均增强,把结合位点突变之后,荧光值显著降低;EMSA结果显示,在第一个预测的结合位点实验中,能够观察到GATA4-Barx1复合体所形成的滞后条带,第二个结合位点未能检测出结合;ChIP结果显示,以GATA4抗体免疫沉淀的DNA片段为模板,PCR扩增获得Barx1基因启动子区的片段,能实现转录因子GATA4与Barx1启动子DNA序列结合。表明Barx1是转录因子GATA4的直接下游靶基因。为了验证转录因子GATA4确实是通过调控Barx1来影响神经嵴相关衍生物的发育,本实验使用了斑马鱼动物模型进行功能实验分析。通过注射反义吗啉代寡聚核苷酸（morpholino,MO）在斑马鱼体内敲低gata4的表达,对照组（control）注射标准化MO作为参照。通过qRT-PCR实验确定,注射gata4 MO能够在斑马鱼体内有效敲低其表达。在斑马鱼受精后72小时（hours post fertilization,hpf）后,gata4 MO组斑马鱼表现出体型减小、下颌骨发育畸形,彩虹色素生成减少、心包水肿等表型;在96 hpf时进行阿尔新蓝染色,gata4 MO组斑马鱼第一对软骨状咽弓（下颌弓）长度减小呈现出严重的后缩畸形。上述结果提示,gata4对维持神经嵴衍生物的正常发育至关重要,gata4可能通过调控barx1来影响神经嵴的发育。为验证上述假说,本研究通过原位杂交实验在24 hpf时,对control组和gata4MO组进行barx1的整胚原位杂交。结果发现:敲低gata4后,斑马鱼第一咽弓处barx1的表达明显下降,qRT-PCR也证实了上述结果。为了分析gata4是否通过调控barx1的表达进而参与了神经嵴发育过程的调控,本研究共注射gata4 MO与barx1的mRNA,以达到敲低gata4后过表达barx1的目的。结果显示:拯救组（rescue）斑马鱼下颌骨的长度、虹膜色素生成等表型均得到部分的有效恢复。综上所述,本研究通过借助两个动物模型证实Barx1作为GATA4的直接下游靶基因,参与了GATA4对神经嵴发育过程的调控。实验揭示了两者在神经嵴发育过程的重要作用,对于理解相关生物学过程具有重要的理论意义,为预防和治疗人类发育相关的疾病提供了理论和实验依据。