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白癜风是一种临床常见的慢性色素障碍性皮肤病,主要由病变部位黑素细胞的缺失或功能丧失引起。有关白癜风发病机制尚未完全阐明。近年来大量研究显示氧化应激在白癜风黑素细胞损毁中扮演了重要角色。正常机体处于氧化-抗氧化系统的动态平衡之下,打破这种平衡会导致机体发生氧化应激损伤。大量证据表明白癜风患者存在氧化-抗氧化水平失衡。白癜风中患者表皮内过量H2O2蓄积,外周血红细胞SOD活性及脂质过氧化水平显著升高,血浆MDA浓度增高,外周单个核细胞中DNA链断裂及DNA碱基被氧化的水平升高,皮损处MSR表达水平及活性明显下降,Nrf2浆核分布比例失调,以及氧化应激相关基因多态性与白癜风遗传易感性相关的大量研究,直接或间接的证实氧化应激在白癜风发病中的重要作用。microRNA(miRNA)是一类非编码单链小RNA分子,长约21-22个nt,主要与其靶基因mRNA通过特异性的碱基互补配对,在转录后对基因进行负表达调控。既往研究显示miRNA分子参与细胞氧化应激反应。在H2O2、电离辐射或依托泊甙等不同条件诱导的氧化应激情况下,存在多种miRNA分子表达异常改变。而在多种发病与氧化应激相关的疾病中,如心力衰竭、心肌病、神经退行性疾病等,表达异常改变的miRNA分子发挥着促氧化反应和抗氧化应激的双向调节功能,提示miRNA分子参与机体抵御应激反应或导致机体氧化应激损伤。因此,寻找与人黑素细胞氧化应激相关的miRNA分子,研究氧化应激条件下miRNA对黑素细胞的功能影响,探讨miRNA参与黑素细胞氧化应激的分子机制,为白癜风机理研究和临床治疗药物开发提供新的思路和理论依据。方法使用适当浓度的H2O2对永生化的人表皮黑素细胞PIG1及永生化的白癜风患者正常黑素细胞PIG3V进行处理,与处理前的PIG1及PIG3V黑素细胞进行microRNA芯片表达谱差异分析,继而通过实时荧光定量RT-PCR进行差异表达验证,初步筛选出相关miRNA进行功能学研究。使用筛选出的miRNA分子特异性前体及抑制物瞬时转染PIG1及PIG3V黑素细胞,设置转染后H2O2处理组,通过检测细胞活力和凋亡,以及细胞内ROS、MDA、SOD、GSTs的表达水平,观察miRNA对H2O2处理黑素细胞氧化应激状态及细胞活性的影响。生物学预测软件预测miRNA可能调控靶基因,通过报告基因试验验证miRNA与预测靶基因之间的关系。RT-PCR及Western Blot试验进一步验证miRNA对靶基因调控作用;基因转染、Western Blot试验和细胞活力检测明确miR-423-5p/GSTM1信号通路在H2O2诱导下人黑素细胞氧化损伤中的作用。结果1.通过对miRNA芯片表达谱进行差异分析,我们发现在使用H2O2处理后,PIG1黑素细胞中有10个miRNA分子表达水平发生改变,其中7个miRNA分子表达上调,3个miRNA分子表达下调;而在PIG3V黑素细胞中,则有3个miRNA分子表达上调,5个表达下调。有3个miRNA分子(miR-93、miR320b和miR-423-5p)在两种黑素细胞中表达均发生改变。进一步通过实时荧光定量RT-PCR对这3个miRNA分子进行验证,结果显示,H2O2处理后miR-93和miR-320b在PIG1黑素细胞中表达较处理前下降(p<0.05),在PIG3V黑素细胞中表达上调(p<0.05),与芯片方向不完全相符;miR-423-5p在H2O2处理后的两种黑素细胞中表达较处理前均上调(p<0.05),且在PIG3V细胞处理前后表达水平具有显著差异(p<0.01),结果与芯片方向一致。2.使用特异性miR-423-5p前体及抑制物转染PIG1和PIG3V黑素细胞,能够成功使黑素细胞中miR-423-5p的表达上调和下调。与未转染组及转染对照组相比,在H2O2处理后上调miR-423-5p表达的黑素细胞,细胞活力降低,凋亡比例增大,细胞内ROS水平及MDA水平升高,而SOD、GSTs活性下降。下调miR-423-5p表达的黑素细胞活力增加,凋亡细胞减少,ROS、MDA水平降低,而SOD、GSTs活性增加。3.通过生物学软件我们初步预测GSTM1是miR-423-5p的靶基因。报告基因试验结果证实,GSTM1通过3’UTR位点与miR-423-5p结合,从而受miR-423-5p的抑制。RT-PCR及Western Blot结果显示,在H2O2处理后,与转染对照组相比,特异性上调/下调miR-423-5p的表达后,GSTM1的mRNA表达无明显变化,而蛋白水平则发生了明显改变。进而我们通过基因转染、Western Blot试验和细胞活力检测发现,miR-423-5p不仅仅可负性调控GSTM1在H2O2诱导下人黑素细胞中的表达,并确实通过下调GSTM1蛋白表达介导了H2O2诱导下人黑素细胞的氧化损伤。结论1. miR-423-5p在H2O2处理前后的人黑素细胞具有表达差异,可能参与黑素细胞氧化应激反应。2. miR-423-5p能够降低H2O2诱导的氧化应激条件下人黑素细胞活力,促进黑素细胞凋亡,增加黑素细胞氧化应激水平,降低细胞抗氧化能力。miR-423-5p是调控人黑素细胞氧化应激损伤的危险性因素。3. miR-423-5p通过GSTM1介导人黑素细胞氧化应激损伤。GSTM1具有抗氧化能力,miR-423-5p影响人黑素细胞的抗氧化能力,导致人黑素细胞的氧化应激损伤,部分是通过对GSTM1表达的负性调控来实现的。