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研究背景:快速诊断肺结核病是预防肺结核病的传播并对之进行及时治疗的有效措施。但是严峻的事实是,肺结核病诊断的金标准仍然依赖于一百多年前发展起来的、阳性率只有30%左右的细菌学实验。所以临床上迫切需要有一种新的灵敏的、特异的、快速的以及安全的肺结核诊断方法。本实验室长期从事肺结核病的早期诊断生物标志物的研究,但是以前我们更多地考虑的是诊断方法的准确性和安全性,缺乏对诊断生物标志物的病理意义进行深入的研究。在肺结核的发病机理研究中,虽然自噬溶酶体在巨噬细胞清除结核分枝杆菌过程中起着至关重要的作用,但是在肺结核病中差异表达的miRNAs生物标志物与巨噬细胞中自噬小体成熟之间的机制尚未阐明。因此,研究肺结核病miRNA生物标志物在巨噬细胞中对自噬溶酶体形成的影响,对了解肺结核病的发生有着重要的意义。研究方法:我们通过Solexa测序筛选了肺结核患者中差异表达的血清miRNAs,并通过qRT-PCR将这些差异表达的miRNAs在更大的样本中进行验证。用逐渐向前逻辑回归的方法对验证为差异表达的血清miRNAs进行拟合,并建立了肺结核早期诊断模型。我们依托生物信息学分析结果,聚焦于自噬体成熟过程,用qRT-PCR、western blot、共聚焦显微成像、电子显微成像、双荧光素酶报告基因系统等实验方法研究了肺结核生物标志物miR-423-5p调控巨噬细胞自噬的分子机制。研究结果:(1)Solexa测序结果显示,在肺结核患者血清中有181个差异表达的miRNAs,其中93个上调,88个下调。(2)QRT-PCR验证结果显示,miRNA-17-5p、miR-20B-5p和miR-423-5p在大样本的肺结核患者血清中差异表达;将这三条miRNAs拟合建立了一个曲线下面积为0.908,预测准确性为78.18%的肺结核诊断模型。(3)细胞和分子生物学结果表明,在巨噬细胞中,上调的miR-423-5p能够抑制自噬小体的成熟,并且这种抑制作用发生在自噬小体-溶酶体的融合阶段,而不是发生在自噬溶酶体降解阶段。(4)双荧光素酶报告基因实验结果表明,Homo VPS33A是miR-423-5p的直接靶基因,Homo 的3’-UTR上的两个CUGCCCCUC序列为miR-423-5p直接相互作用位点。(5)QRT-PCR验证结果显示,在肺结核患者的PBMCs中,miR-423-5p和VPS33A的mRNA的表达水平之间存在负相关性(r=0.37,p=0.02)。结论:(1)我们将三条在活动性肺结核初诊患者中差异表达的miRNAs(miRNA-17-5p、miR-20B-5p 和 miR-423-5p)进行了拟合,建立了 一个快速的、非病原菌接触性、高准确性的肺结核病miRNA诊断模型。该模型的曲线下面积为0.908,它从正常人中鉴别肺结核患者的预测准确性为78.18%(其中敏感性为83.93%,特异性为71.44%)。该模型的预测敏感性显著高于临床肺结核诊断金标准的30%和WHO于2010年新推荐使用的Xpert试验的70%。(2)细胞和分子生物学研究结果表明,在活动性肺结核的发生过程中,上调的诊断标志物miR-423-5p能够通过下调VPS33A的表达,从而在抑制巨噬细胞中的自噬小体-溶酶体融合中起着非常重要的作用。