基于锰类纳米材料信号扩增免疫传感器检测禽白血病病毒的研究

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近年来,禽白血病病毒J亚群(ALV-J)在全球范围内的爆发引发了大规模的禽类死亡,给禽类的养殖业发展带来巨大的经济损失。目前,还没有针对ALV-J的有效疫苗和治疗药物,因此,寻找简单、高效且灵敏度高的方法检测ALV-J变得至关重要。免疫传感分析是将免疫检测与合适的传感器相结合的一种检测技术,具有灵敏度高、响应速度快、简单易操作等优点,为禽白血病病毒的检测提供了有效的检测手段。在免疫传感器的构建中,使用具有生物相容性好、比表面积大等特点的优异纳米材料,提高信号分子的负载量,是实现信号扩增和提高信号检测灵敏度的关键问题。锰是自然界中广泛存在的一种元素,自被发现以来,锰及其化合物被人们广泛应用于生产生活等各方面。本文以锰类纳米材料为基础,研究了中空二氧化锰、三维花簇状二氧化锰、球状碳酸锰等纳米材料的性质,并以这些材料制备信号探针或载体,构建了三种夹心型免疫传感器,研究了其对传感器检测信号扩增的作用,并实现了对禽白血病病毒的灵敏检测。本文主要分为以下三个部分:(1)基于中空二氧化锰(H-MnO2)纳米复合材料制备夹心型电化学免疫传感器检测禽白血病病毒。以单宁还原氧化石墨烯的纳米复合材料作基底连接一抗(Ab1),以中空二氧化锰包覆铜纳米粒子作为二抗(Ab2)载体,制备了夹心型电化学免疫传感器,通过改变溶液pH值释放纳米铜,利用铜的溶出伏安电流作为检测信号实现对禽白血病病毒的高灵敏检测。用单宁还原氧化石墨烯(GR-TA)作电极修饰材料,可以在增强导电性的同时增加Ab1的固定数量。中空结构的二氧化锰增加了信号分子铜的负载量,有效实现了检测信号的扩增,提高检测的灵敏性。在最优检测条件下,通过DPV技术实现了对ALV-J的高灵敏检测,检测范围为102.02104.5.5 TCID50/mL,检测限为101.92.92 TCID50/mL(S/N=3),此外,该传感器具有良好的选择性、重现性以及稳定性,能够实现定量检测ALV-J。(2)为进一步提高传感器的检测灵敏度,利用二氧化锰和钯纳米粒子的纳米复合材料构建了一种夹心型电致发光免疫传感器,用于禽白血病病毒的高灵敏检测。以纳米金(Au NPs)修饰玻碳电极用来固定一抗,制备了MnO2-PEI-Pd复合物作为发光材料Ru(bpy)32+的载体,结合Ab2形成信号探针分子,利用抗原抗体之间的特异性反应,在含有过硫酸钾的检测液中对禽白血病病毒进行检测。三维花簇状二氧化锰具有大的比表面积,能够增加信号分子Ru的负载量。为了进一步放大信号,提高检测灵敏度,将钯纳米粒子与三维二氧化锰结合,增加抗体结合量的同时能够有效催化ECL反应。在最优检测条件下,在101.98104.30 TCID50/mL范围内,ECL信号强度与ALV-J滴度的对数值成良好的线性关系,检测限为101.90.90 TCID50/mL(S/N=3),相关系数为0.994。同时,该免疫传感器具有良好的稳定性、选择性和重复性,为临床定量检测ALV-J提供了有效的工具。(3)利用碳酸锰作为新型电致发光材料构建了夹心型电致发光免疫传感器,简化了传感器构建过程,实现了对ALV-J的灵敏性检测。首先制备了树状高分子-纳米金(PAMAM-Au)复合物作为电极修饰材料固定一抗,然后以球状碳酸锰(MnCO3)作发光材料,用PEI进行修饰,结合Ab2形成信号探针,通过抗原抗体间的特异性免疫反应构建ECL免疫传感器,在含有葡萄糖的检测液中进行检测。PAMAM-Au的使用能够增加Ab1的捕获量。而葡萄糖的加入能够在一定程度上催化活化过硫酸钾,从而实现信号扩增。通过SEM,XRD等对制备的复合材料进行了表征,利用CV对电极修饰过程进行了表征,通过ECL技术完成了对实验的可行性探究、实验条件的优化以及对ALV-J的定量检测。结果表明,在ALV-J滴度101.98104.30范围内,免疫传感器的信号强度与ALV-J滴度的对数值呈正比,检测限低至101.88 TCID50/mL(S/N=3)。此外,该传感器还具有优异的选择性、重现性和稳定性,具有广泛的应用前景。
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