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第一部分:环核苷酸门控通道蛋白A3基因突变对小鼠视网膜组织和视网膜电图的影响 目的：观察环核苷酸门控通道蛋白A3基因突变对全色盲小鼠cpfl5小鼠视网膜电图以及视网膜组织结构在变性过程中变化特点的影响。 方法：实验组选取出生后2、3、5、7、9周的Cnga3基因自发突变的cpfl5小鼠共75只，每组15只;同龄C57BL/6J小鼠（75只）作为对照组。上述5个年龄段的两组小鼠，做F-ERGs检测，记录暗适应杆体反应和明视应锥体反应;做视网膜铺片免疫荧光染色，观察两组小鼠视锥细胞M-视蛋白和S-视蛋白的整体表达分布;做冰冻切片免疫荧光染色观察视锥细胞M-视蛋白和S-视蛋白局部表达分布。 结果：F-ERGs实验结果显示:实验组cpfl5小鼠出生后2周暗适应视杆细胞反应存在，出生后2、3、5周暗适应b波波幅呈上升趋势，5周后开始下降，出生后7周、9周实验组cpfl5小鼠与对照组C57BL/6J小鼠有显著性差异(P＜0.01);对照组C57BL/6J小鼠暗适应b波出生后2周至9周，波幅逐渐增大，逐渐达到成年小鼠的稳定状态。实验组cpfl5小鼠出生后2周明适应锥体反应已经消失，各年龄段与对照组C57BL/6J小鼠比较，均有极显著性差异（P均＜0.001）。视网膜铺片免疫荧光染色结果显示:实验组cpfl5小鼠视网膜锥细胞S-视蛋白表达密度随鼠龄增长逐渐下降，出生3周时视网膜各象限已有明显下降，至pfl5小鼠出生后9周时，除鼻下和颞下象限尚有少量的S-视蛋白，其余象限S-视蛋白几乎完全消失，对照组C57BL/6J小鼠S-视蛋白正常。眼球冰冻切片免疫荧光染色结果显示出生后2周时cpfl5小鼠M-视蛋白异位不明显，出生后3周时颞侧M-视蛋白已从外节异位至外核层，出生后9周，视网膜背侧M-视蛋白已异位至内丛状层。 结论：Cnga3基因突变主要影响cpfl5小鼠视网膜外层视锥细胞，视杆系统影响较小，出生后3周cpfl5小鼠视锥细胞已发生明显变性。 第二部分:新型AAV载体介导Cnga3基因治疗cpfl5小鼠视网膜变性的研究 目的：本实验使用酪氨酸突变的三种AAV载体对Cnga3基因突变的cpfl5小鼠进行基因治疗，通过观察基因治疗后视网膜结构和功能，进一步探究基因治疗的长久性以及筛选今后适用于玻璃体腔注射的载体。 方法：实验组选择出生后14天的cpfl5小鼠120只，分A、B、C三组，每组40只;对照组选择同龄C57BL/6J小鼠40只。用视网膜下腔注射方法将三种不同载体分别注射入每组cpfl5小鼠右眼的视网膜下腔进行治疗，对侧眼不注射做为阴性对照，观察治疗后4、8、12周cpfl5小鼠视网膜电图效果，筛选出最佳载体。继续观察最佳载体治疗后5、9月cpfl5小鼠视网膜电图效果，并通过眼球冰冻切片、视网膜铺片免疫荧光染色方法观察视蛋白恢复情况。 结果：(1)治疗后8周时，三种载体效果最好，随后效果下降;治疗后8周内AAV2(Y272，444，500，730F+T491V)-IRBP/GNAT2-hCNGA3载体效果最好，随后下降明显;AAV8(Y447，733 F+T494V)-IRBP/GNAT2-hCNGA3载体疗效有下降，但较平缓，被选为研究长期疗效和下一步玻腔注射的载体;AAV8(Y447，733F)-IRBP/GNAT2-hCNGA3相比其他两种载体效果较差。(2) AAV8(Y447，733F+T494V)-IRBP/GNAT2-hCNGA3介导的hCNGA3基因表达可以有效阻止视网膜变性，并且疗效可维持9个月及以上。(3)反映视杆细胞敏感度的b波峰时，治疗后4周，治疗眼相比未治疗眼同龄C57BL/6J小鼠，均有统计学差异，说明治疗后4周杆体损伤致反应性减弱。随治疗时间延长，视杆细胞敏感度的b波峰时逐渐恢复，差异缩小。治疗后8周，治疗眼相比未治疗眼，同龄C57BL/6J小鼠，均无统计学差异，说明治疗后8周杆体损伤恢复。(4)治疗后9个月视网膜免疫铺片染色可以观察到S-视蛋白正常表达;眼杯冰冻切片免疫荧光染色可检测到治疗眼视网膜中CNGA3蛋白阳性表达，S-视蛋白和M-视蛋白的正常表达，而未治疗眼均呈异常或阴性表达，说明此载体介导的基因治疗成功阻止了锥细胞M-视蛋白、S-视蛋白的变性消失及移位表达。 结论：AAV8(Y447，733F+T494V)-IRBP/GNAT2-hCNGA3载体介导的hCNGA3基因表达，可以有效阻止cpfl5小鼠的视锥细胞变性，并且治疗效果能长期维持9月及以上，被筛选为下一步玻璃体腔注射的载体。